外泌体(30~150nm大小)是活细胞分泌的最小类型的细胞外囊泡(为30~1000nm)，通过所有体液的循环系统，如血液、尿液和眼泪，作为细胞间的信使。体液外泌体的来源混杂，可以是任何组织和细胞分泌的外泌体然后经体液循环进入。

其中，尿外泌体可以反映病理生理学，并为肾相关功能障碍提供生物学理解，是泌尿系统癌症很有前途的生物标志物来源。

尿外泌体和泌尿/非泌尿器官或细胞之间的遗传网络仍不清楚，本文旨在对尿外泌体bulk RNA-Seq数据进行组织和细胞类型溯源，为外泌体应用于疾病诊断和治疗提供重要理论依据。

本次介绍的文献信息如下：

• 标题：The genetic source tracking of human urinary exosomes
• DOI(url): https://doi.org/10.1073/pnas.2108876118
• 日期及杂志：PNAS October 26, 2021
• 作者及单位：温州医科大学 苏建忠教授团队

文献概述

在我们的体液中，纳米级细胞外囊泡的遗传起源尚不清楚。在这里，我们通过RNA测序对尿外泌体进行了跟踪分析，发现尿外泌体主要表达膀胱的组织特异性基因，并与内皮细胞、基底细胞、单核细胞和树突状细胞有密切的细胞遗传关系。对癌症的差异表达基因进行追踪和相应的富集分析显示，尿外泌体密切参与免疫活动，这表明它们可以作为癌症基因组诊断和精确医学中非侵入性液体活检的可靠生物标志物。

主要结果

结果1—尿液外泌体溯源分析：组织类型溯源

数据情况：

• 116个尿液外泌体样本：lncRNA文库测序 Dataset S1

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• 11个组织特异marker数据：TissGDB http://zhaobioinfo.org/TissGDB

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• 组织 signature matrix：GTEx数据库
  CIBERSORT去卷积分析：尿液中的外泌体主要由膀胱组织分泌，这可能是由于膀胱是储存尿液的地方。

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ssGSEA：观察到肾和胃的TSG在膀胱癌和对照样本中有差异表达(图1B)；相比之下，膀胱、肺、脑和肝脏的TSG在肾癌样本及其对照组中存在差异表达Fig. 1C。

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结果2—尿液外泌体溯源分析：细胞类型溯源

细胞类型signature matrix：
来自于 HCL，human cell landscape (HCL, http://bis.zju.edu.cn/HCL/)的单细胞数据和markers，主要包括肾脏的16种细胞类型与膀胱的16种细胞类型

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CIBERSORT：构建了一个细胞类型矩阵，并研究了外泌体的细胞水平来源(Fig. 1D)：

• 内皮细胞和基底细胞是两种主要来源，可能是因为它们与膀胱和尿道系统密切相关
• 单核细胞、树突状细胞和B细胞等免疫细胞表现出相对较高的基因表达水平：尿中的外泌体强烈参与免疫活动，这可能为通过人类尿液中存在的外泌体来评估免疫功能提供了一种潜在的方法

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结果3—癌症中差异表达基因(DEGs)的来源

bulk RNA-seq分析通常通过识别DEGs来比较不同条件下的转录本丰度。当整个组织的RNA-seq(bulk RNA-seq)完成时，确定基因表达的变化在多大程度上是由于细胞类型比例的变化通常是一个挑战。而这一挑战可以通过单细胞RNA-seq(scRNA-seq)方法来解决。bulk RNA-seq通过去卷积分析，可以估计细胞类型比例的变化。

下面这张图展示了细胞类型的特异性和细胞类型的比例如何导致基因差异表达(DEG)：

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在上图中，形状表示细胞类型，每个形状的数量表示相对的细胞类型比例。颜色代差异分组。点代表每个细胞内基因表达水平。

• 图A：在不同条件下，所有细胞类型中基因表达加倍
• 图B：仅在数量多(细胞数量最多)的（正方形）细胞类型中才有差异表达的基因
• 图C：仅在最罕见(细胞数量最少)的（六边形）细胞类型中才有差异表达的基因，该基因可能无法在bulk RNAseq中被检测到差异表达
• 图D：细胞类型特异性DEG的例子，其中基因在(细胞数量比较多)（方形）细胞类型中差异表达
• 图E：一个高度细胞类型特异性的DEG的例子，其中该基因在罕见的（六边形）细胞类型中有差异表达，该基因仍可被检测为差异表达
• 图F：细胞类型特异性基因的例子，尽管在不同条件下细胞类型比例有变化，但表达水平没有变化。该基因可以在传统的bulk rna-seq分析中被检测为差异表达

因此，作者研究了癌症的差异表达基因(DEGs)的来源：哪些来自整体(bulk)差异分析的DEGs可能由于特定细胞类型的表达变化而出现差异表达。

使用了一个工具scMappR：分配贡献DEG的细胞类型，并确定了cwFoldChange最高的细胞类型

• 肾癌和膀胱癌：内皮细胞（内皮-间充质转化）、中性粒细胞、增殖T细胞和单核细胞中均观察到清晰的基因特征集
• 一定数量的尿外泌体DEGs来自免疫细胞，在通路水平上具有共同的免疫功能，反映了尿外泌体在癌症的起始和进展过程中强烈参与免疫活动

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结果4—癌症的生物标志物:DEGs

• 随机森林模型：DEGS是否可以作为癌症的生物标志物
• 肾脏或膀胱数据集：被随机按4：1的比例分为训练集和验证集
• 预测肾癌marker panel：26个基因
• 预测膀胱癌marker panel：19个基因
• marker panel：Datasets S5 and S6

肾癌标志物中的S100A10和CCAR1，膀胱癌标志物中的CD248和MT-ATP已被证明在尿癌中具有促进肿瘤的功能

意外发现：DDX17的表达水平呈明显的变化趋势：肌肉浸润性膀胱癌 > 非肌肉浸润性膀胱癌 > DDX17表达，这可能是由于人类RNA解旋酶DDX17通过调节几种DNA和染色质结合因子的选择性剪接来促进肿瘤细胞的侵袭性

各组的基因组合可以提高肿瘤样本与相关良性疾病样本的准确性，对这两种尿路癌的早期诊断具有指导意义

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文章主要结论

主要结果：

• 在组织和细胞水平上研究了尿外泌体的遗传来源，发现膀胱、内皮细胞、基底细胞、单核细胞和树突状细胞可能密切参与了尿外泌体的形成
• 通过在细胞水平上跟踪泌尿系统癌症的DEG，并分析其富集通路，报道了泌尿系统外泌体在癌症发展过程中密切参与免疫活动。
• 从外泌体RNA中进行进一步的生物标志物研究，发现了两组标志物集，可以区分癌症和非癌症泌尿系统疾病，AUC值>为89.8%

研究意义：

• 外泌体跟踪分析可以为分子尿液的诊断和预后提供一种实用、无创的方法

文献中使用的软件scMappR利用单细胞数据构建signature matrix来对bulk RNA-Seq进行去卷积分析，我们下期介绍~~~