摘 要: 近年来, 多肽类药物是国内和国际上新药研发的重点方向, 并且多肽类药物研发也是国家重点支持发展的领域之一。 多肽药物的研发的关步骤是酰胺键的形成, 而缩合剂是酰胺键形成的关键, 现有的多肽类缩合试剂很多都有严重的弊端,像传统的多肽类缩合试剂会活化 α 类氨基酸而导致产物消旋化和其他副产物的生成, 开发高效、 副反应少的多肽缩合试剂尤为重要。 本文综述了多肽合成中缩合试剂的研究进展, 以便为多肽类药物的开发提供参考。
关键词: 多肽; 多肽药物; 缩合剂; 酰胺键
目前, 多肽类药物在人类疾病治疗方面越来越重要, 且在众多领域发挥重要作用, 特别在肿瘤、 糖尿病治疗方面已表现出不错的治疗效果[1]。 如何构建酰胺键是多肽药物分子合成的核心, 而酰胺键的形成涉及两是个关键点: 一是活性基团的保护与脱保护; 二是缩合剂的改造开发。 在过去的 100 多年时间里, 化学家探索出了各种各样的构建酰胺键的方法, 然而真正能够适用于多肽合成的方法却少之又少。 目前, 在多肽合成中主要有三种方法: 分别是酰基叠氮法、 酸酐法以及缩合试剂法[2]。 酰基叠氮法是最早用于肽键合成的方法, 然而, 此方法形成的酰基叠氮中间体不稳定, 会产生有毒物质, 且制备过程较为复杂。 酸酐法由于其成本低廉, 被广泛应用于工业生产中, 但是该方法生产条件较为苛刻, 且反应过程中 α-手性氨基酸常常因为过度活化而导致外消旋化。 由于天然 α-手性氨基酸便宜易得, 因此目前应用最广泛、 最可行的多肽合成方法为缩合试剂法, 且在缩合剂活化下, 酸胺即可直接作用形成肽键, 无需预制备酰卤等中间体, 提高了原子经济性和产物的收率, 缩合剂法制备多肽类药物在肽类药物研发领域得到了广泛应用。
1 碳二亚胺型缩合剂
1995 年, 第一个碳二亚胺型缩合剂被使用[3]: N,N'-二环己基碳亚胺(DCC)(图 1), 此缩合剂是第一个被用于多肽合成的缩合剂, 时至今日, DCC 仍然广泛应用于多肽合成中。
然而, DCC 做多肽合成的缩合剂时也存在着许多弊端, 反应副产物 N,N-二环己基脲(DCU) (图 2)在甲醇、 水、 乙酸乙酯、 二氯甲烷等有机溶剂中几乎不溶解, 用柱层析等方法也很难分离, 但是可以通过过滤的方法将此副产物滤除, 故此缩合剂仍然被广泛应用于多肽药物的合成中。 随后化学家也开发出了一些新型碳二亚胺类缩合剂, 主要有 N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)和 1 -(3 -二甲氨基丙基) - 3 -乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)(图 3), 这些新型缩合剂很好的解决了副产物难溶解的缺点, 副产物可以通过柱层析等方法除去, 但是由于其活性过高, 在不加任何消旋抑制剂的情况下, 产物往往容易消旋[4]。为了解决这个问题, 化学家开发出了许多的消旋抑制剂, 像 1-羟 基 7 - 偶 氮 苯 并 三 唑 ( HOAT)、 N - 羟 基 琥 珀 酰 亚 胺 酯(HOSU)、 1-羟基苯并三唑(HOBT)等(图 4), 在缩合反应中时加入这些消旋抑制剂, 不仅能有效的抑制消旋, 而且也可以有效的抑制副产物 DCU 的产生[5]。 在这些添加剂中以 HOBT 应用最广, DCC-HOBt 复合试剂已成为目前使用最广泛的缩合方法之一。
2 磷正离子型缩合剂
在多肽药物的合成中最早使用磷正离子型缩合剂可追溯到20 世纪 70 年代, CloP8 和 BroP9 被用作多肽合成的缩合试剂,然而, 使用这两种缩合剂会使产物产生严重的外消旋化, 因此, 此类缩合剂被逐渐的淘汰。 到 1975 年, Castro[6] 开发并制备了另一种基于 HOBt 的磷正离子型缩合剂 CloP-HOBt, 又称BOP, 此类磷正离子缩合试剂包括邻苯二甲酰丁辛酯(BOP)、3-(二乙基氧基)-1,2,3-苯并三嗪-4-酮(DEPBT)和双(2-氧代 3-恶唑烷基)次磷酰氯(BOP-Cl)等。 此类缩合试剂不仅制备工艺较为简单而且不含有结晶水, 反应时长能大幅缩短, 因此, 在环肽的合成中被广泛使用, 但是此缩合剂也有一定的缺点, 在合成中使用会产生具有致癌危险型的副产物六甲基磷酰胺(HMPA)[7], 因此 BOP 类缩合剂逐渐被六氟磷酸苯并三唑-1-基氧基三吡咯烷基(PyBOP)(图 5)取缔, 因为 PyBOP 具有相对而言较好的反应活性, 其副产物危害性也较小。
在碱性条件下，BOP类缩合试剂被羧基上的氧负离子进攻后生成酰卤磷正离子，苯并三唑氧基氧负离子进攻酰卤磷正离子活泼中间体生成苯并三唑酯，最后苯并三唑酯与氨基反应得到相应的肽键。氨基也可以直接与少量的酰氯磷正离子或酸酐反应生成目标产物(图6)。
尽管基于HOBt的磷正离子型缩合剂在含普通氨基酸多肽的制备中显示了优异的性能，但是在具有高空间位阻的肽制备中的表现却不太理想，产物的收率较低且具有很大程度的消旋[8]。后来科学家基于HOAT开发了六氟磷酸-7-氮杂-苯并三唑-1-基-氧基 三-(二甲胺基)膦(AOP)、3H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡 啶-3-氧基)三-1-吡咯烷基鏻六氟磷酸盐(PyAOP)、溴化三(二甲基氨基)磷六氟磷酸(BrOP)、三吡咯烷基溴化鏻六磷酸盐(PyBrOP)等，此类缩合剂能很好促进有空间位阻的酰胺键的合成，并在N-甲基氨基酸或C，C-二烷基化氨基酸的多肽及生物活性肽的合成中使用，但是此缩合剂价格较为昂贵而不适合大规模的使用。
3 脲正离子型缩合剂
在1978年，基于HOBt的脲正离子缩合剂苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)首次被用做缩合试剂[9]，并成功使用到多肽合成中，随后开发出了许多基于HOBt、HOAt等脲正离子缩合试剂。例如2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、O-苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基 脲四氟硼酸酯(TBTU)、o-(苯并三氮唑-1-基)-二 (四氢吡咯基)碳鎓六氟磷酸盐(HBPyU)(图7)等。
HATU、HBTU在多肽合成具有较好的效果，有反应时间短、收率高、产物不易消旋等优点。HATU是目前多肽合成中最常用的脲正离子型缩合试剂，能很好克服空间位阻的肽键的形成，很多缩合反应都需要在无水条件下才能达到比较理想的收率，而HATU是一种吸水性缩合试剂，溶剂不需要除水即可达到理想的收率[10]，但在多肽合成反应中，HATU需要加入有机碱以活化氨基酸，例如，N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)、N-甲基吗啉(NMM)等，其中以DIPEA最为常用。HATU在普通溶剂中很难溶解，在液相合成多肽中，常用的溶剂为DMF(N，N-二甲基甲酰胺)，DMF的去除需要用到高沸点旋蒸仪或者用油泵脱除，较为麻烦，且在肽合成中这类缩合剂易于氨基反应生成胍衍生物，较难除去。
在碱性条件下，氨基酸上的羧基游离为羧基负离子，羧基负离子进攻HATU，通过加成消除反应产生中间体O-酰基(四甲基)异脲盐，紧接着7-氮杂苯并三氮唑氧负离子(OAt-)进攻中间体O-酰基(四甲基)异脲盐，生成活性酯和四甲基脲，碱性试剂与活性酯进行加成消除反应即可得到相应的酰胺键 (图8)。
由HOBt等脲正离子缩合试剂衍生的缩合剂TBTU、O-(苯并三氮唑-1-基)-二 (四氢吡咯基)碳鎓六氟磷酸盐(HBPyU)等就没有此副反应，但是在肽合成反应中，用此类缩合剂产物的收率一般较低且容易消旋化。因此急需开发出新型脲正离子缩合剂在肽合成中越发重要。
4 炔酰胺类缩合剂
1995年，Arens[11]发现了一种不同于DCC的缩合剂乙基乙炔醚，这种缩合剂和DCC 一样也能使羧酸和胺反应形成酰胺键。然而这种缩合剂存在许多弊端，列如：热稳定性较差，在高温下易分解、催化活性低、胺与具有手性的羧酸反应时，羧酸容易消旋，并且此缩合剂在空气中也极不稳定[12]。为了解决这些问题，Viehe等[13]于1964年开发了炔胺类缩合试剂，这种炔胺缩合试剂相较于炔醚缩合试剂其缩合活性有了较大的提升，但是其热稳定性反而更差，在空气中也更加敏感，其制备困难不易保存，在肽缩合反应中会产生严重的消旋。在1978年，Gais和 Neuenschwander 等对炔胺缩合剂进行了修饰，他们试图通过“推拉电子效应”在炔胺的另外一侧引入吸电子的乙酰基来解决炔胺类缩合剂的问题，尽管改造后的炔胺缩合剂在稳定性方面有所提升，但是，在肽缩合中其严重的消旋问题仍然存在。虽然科学家经过了不断的努力，但是炔酰胺缩合试剂存在的弊端并不能完全同时解决，炔酰胺类缩合试剂的开发研究被科学家所抛弃。在2012 年，Lam等报道了炔酰胺与羧酸可以在钯催化的条件下发生加成反应生成酰氧基烯酰胺。2015年，毕锡等发现该反应在 100 ℃的条件下不需要使用过渡金属催化剂也能顺利进行(图9)。
2020年，刘涛等[14]认为炔胺类缩合剂造成的严重外消旋化应该归结于其自身的碱性会促使其从羧基 α-位的手性碳原子上攫取氢原子，从而诱发 α-手性中心的消旋，因此，他们提出在炔胺的氮原子上引入一个吸电子基团，通过降低氮原子上的电子云密度，不但可以达到稳定炔胺的目的，更为重要的是有望降低炔胺的碱性，进而达到抑制消旋的效果。经过不断的筛选，他们筛选出了 N-甲基乙炔基甲磺酰胺(MYMsA)和 N-甲基乙炔基对甲苯磺酰胺(MYTsA)这两种炔酰胺缩合试剂，并且在肽合成中进行了一系列实验，他们发现：在肽合成中用二氯甲烷作溶剂就可以将羧酸快速的反应并且收率很高，而中间体α-酰氧基烯酰胺也能够与胺快速的反应，并且以几乎定量的收率得到目标酰胺。他们以炔酰胺作为缩合试剂对羧胺缩合进行了分类考察，脂肪羧酸、芳基羧酸、杂环羧酸和 α，β-不饱和羧酸都能顺利地反应，得到目标产物，并且收率较高。他们在普适性考察中也发现几乎所有的二肽都能在炔酰胺缩合剂 的作用下与胺缩合得到目标肽，即使是位阻较大的氨基酸也可以反应，并且收率良好，炔酰胺类缩合剂不仅可以用于普通酰胺和二肽的合成，而且也能够用来促成多肽片段连接。与传统的肽缩合试剂相比，炔酰胺缩合试剂具有反应条件温和、缩合效率高，最主要的在缩合过程中α-手性中心不发生消旋，因此，炔酰胺类缩合剂是一种不错的肽缩合试剂。
5 结 语
目前已上市的药物中有很大部分为多肽类小分子药物，如何安全、高效、低成本研发多肽类药物仍然是急需解决的难题，然而解决此问题的关键是如何筛选合适和高效的肽缩合试剂。尽管已经研发出了许多的肽缩合试剂，但是都存在一定的缺陷，例如：碳二亚胺型缩合剂在肽合成中产物易消旋，副产物难以除去等缺点，磷正离子型缩合剂虽克服了产物易消旋的缺点，然而磷正离子型缩合剂价格比较昂贵，不适合规模化应用，并且反应过程中会产生毒性副产物；脲正离子型缩合试剂是目前较为成熟且效果最好的肽缩合试剂，以HATU介导的二肽氨基酸缩合其收率超过80%，且反应速率快、条件温和，但是反应需要添加有机碱。炔酰胺类缩合剂在多肽合成中表现出优异的性能，有望成为一种高性能的肽合成缩合试剂，但是仍然存在一些问题，例如，炔酰胺类缩合剂在肽键合成中反应效率较低，使得其很难应用于固相合成中，需要进一步的深入研究，提升炔酰胺类缩合剂的合成性能，使其早日成为一种有使用价值的肽缩合试剂。
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