一、实验原理
将烟草的外植体（愈伤组织）与农杆菌共培养，在共培养过程中，农杆菌会附着在烟草外植体细胞的表面，并将 T-DNA 转移到烟草细胞中。T-DNA 携带的目的基因会随机整合到烟草细胞的基因组中。最后，利用植物细胞的全能性，通过组织培养技术，将转化后的烟草细胞培养成完整的转基因植株。
二、实验目的
通过农杆菌介导等技术将目的基因导入烟草细胞，经组织培养获得目标性状稳定表达的转基因烟草植株，以用于基因功能研究、品种改良或生物制品生产等。
三、实验步骤
1.载体构建
（1）基因设计与载体构建
输入：客户提供目标基因序列或委托设计
操作：构建 CRISPR/过表达/RNAi 载体（如 pCAMBIA2300）
质控：酶切鉴定+测序验证
2.遗传转化
（1）农杆菌转化与培养
转化农杆菌：取 50 μL 农杆菌感受态细胞（冰上融化），加入 1-5 μL 重组质粒（约 100-500 ng），轻混匀。冰浴 30 分钟。热激：42℃水浴 90 秒，立即冰浴 2 分钟。加入 500 μL LB 液体培养基（不含抗生素），28℃振荡复苏 3-4 小时（200 rpm）。离心（4000 rpm，5 min），弃部分上清，留约 100 μL 重悬菌体。涂布于 LB 平板（含质粒抗性如 Kan 50 mg/L + Rif 50 mg/L），28℃倒置培养 48 小时。
阳性验证：挑取阳性单菌落至LB 液体培养基（含Kan 50 mg/L + Rif 50 mg/L），28℃振荡培养至OD₆₀₀=0.5，离心重悬于 MS 液体（含 150 μM AS）。
（2）准备外植体
切取烟草无菌苗的叶片，约 0.5-1cm^2。平铺于预培养培养基。
（3）侵染及共培养
将农杆菌转入侵染液中，充分振荡混匀，测量 OD 值为 1.8-2.0，备用；4000rpm 室温离心 10 min，用 dd 重悬菌体。4000 rpm 室温离心 8 min，用 40 ml MS 盐培养基重新悬浮菌体。将预培养的子叶浸泡在 MS 盐培养基重悬的农杆菌菌液中 15 min。倒出液体，用无菌滤纸将叶片的菌液充分吸干（防止农杆菌残留而造成的污染）。将侵染完成的叶片组织均匀的转入预先准备的共培养培养基中，放置于 23℃的黑暗培养箱中共培养 2d。
（4）筛选
共培养两天后，将子叶转到抗性培养基上。26 ℃（16 hr 光照）/18 ℃（8 hr 黑暗）培养；之后每三周换一次培养基，直至形成愈伤。
（5）分化
愈伤形成后，将其转移到分化培养基上诱导出芽成苗。分化条件为 26℃光照培养室培养 3-4 周（光照条件为 16h 光照+8h 黑暗）；
（6）生根
待愈伤组织分化出生长点后，用小刀切取生长点，并将其转移到生根培养上进行生根筛选，在 26 ℃光照培养室（16h 光照+8h 黑暗）培养 2-3 周。
3.转基因植株验证
（1）PCR检测
提取转基因植株基因组 DNA，用载体特异性引物扩增抗性基因（引物示例：Kan-F:5′-GTCGCTGTAGGTATCGCTATTG-3′,kan-R: 5′-GTTTACGCGTTGCTTCCGCCA-3′），电泳验证目标条带。选择获得抗性基因的阳性株系检测敲除，在 CRISPR 编辑位点前后设计引物进行测序检验敲除情况。
（2）qPCR 检测表达量
针对待测基因设置 3 对引物，进行 qPCR 检测，以确定合适的扩增引物。设计三对引物检测目标基因表达量变化（对比野生型）。
（3）Sanger测序
提取基因组后送 Sanger 测序。
四、遗传转化节点图展示
五、实验结果图
1.过表达抗性基因 PCR 鉴定（默认含有）
如图所示，提取基因组后进行菌 P，与CK 相比，成功获得抗性产物条带。
2.过表达目的基因 PCR 鉴定（可选）
3.过表达目的基因 Sanger 鉴定（可选）
4.过表达 qPCR 鉴定（可选）
如图所示，提取RNA 后对荧光定量数据进行分析。
结论：如图所示，超量表达该基因后，阳性株系相对于野生型的表达量升高。
5.基因敲除抗性基因 PCR 鉴定（默认含有）
如图所示，提取基因组后进行菌 P，与CK 相比，成功获得抗性产物条带。
6.基因敲除目的基因 PCR 鉴定（可选）
如图所示，提取基因组后进行菌 P，成功获得目的基因产物条带。
7.基因敲除目的基因 Sanger 鉴定（可选）
通过 PCR 条带可以挑选与阳性条带大小一致的，从而筛选出阳性植株，对阳性植株进一步 Sanger 测序。
TIPS:
高效实验流程：针对本氏烟草具备即需即启的遗传转化能力；采用农杆菌介导法，实现快速高效、稳定可靠的转基因体系，以单拷贝插入为优势特征，保障后续功能验证；
多样化检测方式：可提供针对烟草抗性植株的PCR、荧光定量PCR、Sanger测序鉴定结果。
