Transcriptome profiling of the low-salinity stress responses in the gills of the juvenile Pseudopleuronectes yokohamae
黄盖鲽响应低盐度胁迫的鳃部转录组分析
期刊：Comparative Biochemistry and Physiology 发表单位：大连海洋大学
导 读
思路：动物实验及RNA-seq测序 --> 转录本从头注释 --> 差异表达基因分析，GO、KEGG功能富集分析 --> qRT-PCR验证。
图表：基因差异表达火山图，功能富集分析柱形图；功能注释统计表，富集通路统计表等。
摘 要
盐分是影响鱼类生命周期的重要环境因素，包括生长、发育和繁殖。黄盖鲽是重要的鱼类资源，是研究渗透压的良好模型，因为它可以适应多种盐度水平。该物种基因组资源的缺乏阻碍了对其耐盐性机制的研究。本篇研究通过RNA-Seq，鉴定了暴露于不同浓度盐分环境的黄盖鲽鳃组织中参与盐分适应和渗透调节有关的基因。转录本组装后，Nr数据库注释了19265个基因。两种盐度组之间的表达比较显示，与高盐度组相比，低盐度组中有673个差异表达基因，包含180个上调与493个下调基因。通过富集分析确定了潜在的功能，包括离子转运、能量代谢和蛋白质合成以及免疫反应。该项研究是黄盖鲽的首次转录组学研究，它揭示了许多新颖的序列，可用于进一步的生物学分析。在基因表达分析中鉴定的候选基因为洞察黄盖鲽适应盐度变化的渗透调节机制提供了见解。
前 言
盐度是影响鱼类生存的最重要的生态因素之一。鳃由于其具有与外部环境直接接触的较大表面积，是鱼类重要的渗透调节器官，因此盐度对鳃渗透调节的影响成为水生生物学研究的重点。
黄盖鲽是重要的鱼类资源，具有对各种环境的强烈适应能力，包括盐度耐受。目前尚未在全转录组水平上对黄盖鲽进行任何研究，包括其渗透调节机制。本篇研究旨在提供有关该鱼类的重要转录组信息，通过揭示不同盐度水平下黄盖鲽鳃转录组差异，评估在盐度变化中起潜在作用的基因，为全面理解黄盖鲽渗透压调节机理提供了有价值的信息。
方 法
动物试验和RNA测序
建立两个盐度组：一组为天然海水，代表高盐度组（HG）；另一组为低盐胁迫，代表低盐度组（LG）。两周后，每组获取10个个体，提取鳃组织RNA以及RNA-seq测序。
转录本拼接注释
测序后，为了获得全面的基因功能信息，拼接转录本后，基于Nr、Nt、Pfam、KOG、Swiss-Prot、KEGG和GO数据库对组装的转录本进行功能注释。KEGG通过KAAS注释，GO通过Blast2GO注释，其余通过BLAST序列比对。
差异表达分析
bowtie2将测序reads比对至组装后的转录本序列中，edgeR执行标准化reads count值并基于fold change≥2和FDR<0.05鉴定差异基因（DEG）。GOseq执行DEG的GO富集分析，KOBAS执行DEG的KEGG富集分析。
qRT-PCR验证
选取代表性的15个基因，通过qRT-PCR验证RNA-seq数据的准确性。
结 果
1 黄盖鲽转录本组装（无参考基因组物种）
共获得203747个转录本，N50为1778 bp。使用Nr、Nt、Pfam、KOG、Swiss-Prot、KEGG和GO数据库对转录本进行注释分析，表2总结了基因功能信息。2 转录组功能分析
Nr数据库注释确定了有关基因功能以及与其它硬骨鱼类的基因相似性信息。
GO注释表明，共计15809个带注释的转录本分配为54类GO，包括10类分子功能（MF）、19类细胞组分（CC）和25类生物学过程（BP）。2级GO分类水平表明，MF中的催化活性（GO：0003824）和结合（GO：0005488，BP中的细胞过程（GO：0009987）、生物过程调节（GO：0050789）、代谢过程（GO：0008152）、生物调节（GO：0065007）和单机体过程（GO：0044699）， CC中的细胞部分（GO：0044464）、膜部分（GO：0044425）和膜（GO：0016020）是三个GO大类中最常见的注释（图2）。
图2，黄盖鲽转录本的GO分类图。
KOG注释表明，共计12487个带注释的转录本分配为26类KOG。信号转导机制是最高频类别（2590），随后是一般功能预测（2396），翻译后修饰、蛋白质转换和伴侣（1226），转录（895）以及胞内运输、分泌和囊泡运输（795）（图3）。
图3，黄盖鲽转录本的KOG分类图。
KEGG注释表明，共计12036个带注释的转录本分配为232种KEGG途径，可归类为五个主要类别（图4）。
图4，黄盖鲽转录本的KEGG分类图。
3 差异表达基因分析
基于fold change≥2以及P<5，鉴定低盐度组（LG）和高盐度组（HG）之间的差异表达基因（DEG），共获得673个基因。相对于HG，LG中有180个上调DEG，493个下调 DEG（图5）。
图5，差异表达基因的火山图。
4 DEG的GO和KEGG富集分析
对673个DEGs进行GO富集分析。细胞组分中存在大量的富集，主要涉及细胞质（GO：0005737）、细胞内非膜结合细胞器（GO：0043232）、膜区域（GO：0098589）、质膜区域（GO：0098590）和质膜（GO：0009897）。生物学过程和分子功能中仅有少数富集。对于生物学过程，主要涉及系统发展（GO：0048731）、多细胞生物过程调节（GO：0051239），解剖结构发展（GO：0048856）和单-多细胞生物过程（GO：0044707）。对于分子功能，主要涉及丝氨酸内肽酶活性（GO：0004252）、丝氨酸肽酶活性（GO：0008236）、丝氨酸水解酶活性（GO：0017171）和结构分子活性（GO：0005198）（图6）。
图6，差异表达基因的GO富集分析。
共计265个DEG分配了KEGG注释，发现它们参与了几种特定的途径。通过相关文献检索，可主要归属为3大类：离子转运、免疫应答以及能量代谢和蛋白质合成。
5 qRT-PCR验证RNA-seq
为了验证上述RNA-seq的准确性，通过qRT-PCR对15种代表性的差异表达基因进行验证，结果证实数据是可靠的（图7）。
图7，qRT-PCR验证基因表达。
讨 论
在本篇的讨论部分，作者引证了大量相关研究，详细阐述了差异表达基因所涉及的途径可能在渗透调节中的分子作用。
综上，本篇研究基于RNA-Seq，提供了黄盖鲽响应盐度变化的转录组特征的第一份报告。研究结果从头注释了黄盖鲽转录本，丰富了该物种的基因组信息，并揭示了响应盐度变化的673个差异表达基因。研究表明，复杂的调节网络参与了多种生物过程，包括离子运输、能量代谢和蛋白质合成以及免疫反应，对于理解黄盖鲽渗透调节和盐分适应的分子基础具有重要价值。
