RNA结合蛋白（RNA-binding proteins，RBPs）对转录后基因调控至关重要，包括RNA修饰（如N6‑甲基腺苷酸化（m6A））、剪接、多聚腺苷酸化、定位、翻译和降解。RBPs的失调与多种人类疾病密切相关，包括癌症、神经退行性疾病、代谢紊乱和组织分化异常。尽管传统上对RBPs的研究主要集中于其与RNA、蛋白质和翻译后修饰的相互作用，但越来越多的证据表明，小生物分子（small biomolecules，SBMs），例如糖类、核苷酸、代谢物（如S‑腺苷甲硫氨酸（SAM）和NAD(P)H）以及药物，可以直接与RBPs结合，并调节其结构、定位和RNA结合活性。这些依赖于情景和浓度的相互作用将RBP调控与细胞代谢联系起来，是当前研究的重点。在本综述中，我们将探讨SBM结合RBPs的不断扩展的研究进展，以及这些RBPs在凝聚体形成、RNA定位、加工和翻译中的功能。我们将重点阐述这些相互作用的分子机制及其与人类疾病的功能相关性。此外，我们还将探讨SBM‑RBP相互作用鉴定方面的最新进展，以及推动这一快速发展领域取得突破性发现的创新方法。总之，这些见解凸显了SBMs在调节RBPs和开发新型治疗策略方面的潜力。
在人类基因组编码的约20,000种蛋白质中，RNA结合蛋白（RBPs）代表了一个非常丰富且功能多样的类别，包含1,500多个成员，占人类基因组中所有蛋白质编码基因的7.5%以上。RBPs通常在人类细胞中高表达，这凸显了它们的功能重要性。RBPs通过直接与RNA接触，协调转录后和共转录基因调控的几乎所有方面，例如RNA加帽、剪接、运输、稳定性和翻译。RBP表达、活性或定位的扰动与癌症、神经退行性疾病、代谢紊乱和组织分化异常的发病机制密切相关。
尽管翻译后修饰和蛋白质‑蛋白质相互作用等机制已被证实是RBP活性的调节因子，但近期研究揭示了由小生物分子（SBMs）介导的另一层调控机制。这些小生物分子包括糖类、核苷酸、代谢物和合成化合物，它们可以直接与RBP结合并调节其活性。SBM的结合可以改变RNA的结合亲和力，影响亚细胞定位，并驱动RBPs的构象转变，从而实现对其功能的快速、可逆控制。这种调控模式不仅限于已充分表征的ATP依赖性RNA解旋酶，还包括与腺苷甲硫氨酸（SAM）、GTP、α‑酮戊二酸和其他细胞代谢物结合的蛋白质——这表明RBP活性受细胞代谢状态的调控。
对SBM‑RBP直接相互作用的分析不仅提高了我们对代谢与RNA调控整合的理解，也为靶向疾病相关RBPs的治疗提供了新的契机。本文综述了SBM直接结合调控人类经典RBPs的新兴原理。我们根据RBPs的SBM结合特性对其进行分类，重点阐述了这些相互作用的分子和功能后果，并探讨了与SBM结合的RBPs相关的疾病，包括RBP抑制剂在疾病治疗中的作用。最后，我们讨论了目前研究SBM‑RBP相互作用的方法及其面临的挑战。
小分子生物分子‑RNA结合蛋白相互作用概述
在已鉴定的1,542种RNA结合蛋白（RBPs）中，有226种具有与小分子（不包括金属离子）结合的基因本体术语（补充图1a），这表明小分子结合对于RBPs来说并不罕见。通过整合基因本体术语和文献综述，我们系统地将结合小分子的RBPs（不包括模板依赖性聚合酶）分为七个主要类别：ATP结合、GTP结合、糖结合、二氢尿苷合成酶（DUS）、非模板依赖性聚合酶、甲基转移酶和脱甲基酶（双加氧酶）（补充图1b）。RBPs的内源性小分子配体包括ATP、GTP和SAM（补充图1c），它们分别被解旋酶、翻译因子和甲基转移酶利用。这种对核苷衍生物的偏好进一步延伸到结合还原型NAD(P)H的DUS和NAT10（也称为RNA胞苷乙酰转移酶），后者与其他小分子（例如乙酰辅酶A）相互作用。除了经典的酶-底物和酶-辅因子相互作用之外，结合小分子的RBPs还表现出多种功能。在本节中，我们将讨论这些RBPs的各种功能类别以及它们相关的SBMs如何调节其活性。
RNA解旋酶
人类已报道超过60种经典的RNA解旋酶，它们均属于SF1或SF2超家族。这些超家族共享一个保守的核心结构域，即两个RecA样结构域RecA1和RecA2，它们协同结合核苷三磷酸和RNA，但通常缺乏RNA特异性。SF2超家族包含DEAH-box和DEAD-box解旋酶，它们共同构成了人类RNA解旋酶的大多数。“DEAD/DEAH”的命名源于直接与ATP接触的氨基酸序列；然而，对这些家族的分类不仅依赖于这些基序，还依赖于整个解旋酶结构域的更广泛序列比对。在功能上，DEAH-box和UPF1样解旋酶与RNA的连续易位和“绞合”机制相关，通过链牵引改变远端RNA的结构。然而，并非所有DEAH解旋酶都表现出持续运动。相比之下，DEAD box解旋酶主要参与短RNA双链的解旋，而不发生易位。虽然许多RNA结合蛋白通过结合暴露的碱基来促进RNA单链化，但只有典型的解旋酶利用核苷酸水解来驱动RNA解旋。
ATP与RNA解旋酶的RecA结构域结合，结合位点远离RNA结合位点（补充图1d）。RecA结构域的功能类似于一对钳子，当ATP结合时，它们会夹住RNA，从而将RNA链拉开；当ATP水解时，它们会重新打开。一个典型的RNA解旋酶循环，例如DDX3X的循环，涉及几个构象变化：单体无配体状态对双链RNA（dsRNA）具有亲和力，二聚体与dsRNA结合形成“预解旋复合物”；解旋酶与ATP结合后，诱导预解旋复合物发生构象变化，导致每个DDX3X单体拉开一条RNA链，最终导致dsRNA解旋并形成解旋后复合物。ATP水解随后引发一系列构象变化，导致单链RNA（ssRNA）的释放，形成解旋酶释放后状态（图1a）。结构研究表明，第一种状态和最后一种状态具有相似的构象，区别仅在于是否存在结合的ADP。
尽管ATP在解旋酶功能中起着至关重要的作用，但ATP的可用性不太可能是解旋酶调控的限制因素。据报道，RNA解旋酶对ATP的亲和力通常在中微摩尔范围内（约100μM或更低），而细胞内ATP浓度通常在低毫摩尔范围内。鉴于ATP水平在所有生命领域都保持较高水平，且细胞内ATP浓度通常高于ADP水平，因此只有ATP亲和力极低的解旋酶才可能受到ATP可用性的调控，但目前尚未有此类实例报道。然而，未来对不同细胞区室中ATP/ADP/Mg2+比值的研究或许能够揭示解旋酶调控的新机制。
RNA甲基转移酶和去甲基酶
人类所有RNA甲基转移酶均以SAM为辅因子，而所有已知的RNA去甲基化酶均依赖于α‑酮戊二酸。SAM由甲硫氨酸腺苷转移酶催化ATP和甲硫氨酸合成，是一种核苷衍生的SBM，其结构与腺苷相连（补充图1c）。
甲基转移酶至少可以分为五个家族，其中Rossmann折叠家族（也称为七β折叠家族）是最大的家族，包含至少49个人类基因，此外还有进化上保守的SPOUT家族。主要的RNA甲基转移酶属于这两个家族，包括NSUNs、tRNA甲基转移酶（TRMTs）和甲基转移酶样蛋白（METTLs）。SPOUT家族几乎专门负责tRNA和rRNA的甲基化，而罗斯曼折叠甲基转移酶则表现出更广泛的底物特异性。本节讨论的所有甲基转移酶都属于罗斯曼折叠家族，但TRMT10C除外，它属于SPOUT家族。
相比之下，人类RNA去甲基化酶数量较少，且它们都属于Fe(II)/2-酮戊二酸依赖性双加氧酶超家族。从进化角度来看，它们被分为ALKBH家族（包括FTO和ALKBH蛋白）和TET蛋白家族（补充图1b）。ALKBH酶可以去除多种RNA、DNA和蛋白质的甲基化修饰，其中ALKBH2是唯一尚未被报道作用于RNA的酶。尽管结构相似，但ALKBH家族成员由于RNA识别元件、催化裂隙大小和非同源结构域的差异，表现出不同的底物偏好。
高通量测序技术的进步揭示了转录组中RNA甲基化修饰的广泛存在。其中，N6‑甲基腺苷（m6A）最为丰富。至少有七种甲基转移酶参与m6A的沉积，包括METTL3‑METTL14、METTL4、ZCCHC、METTL5、METTL16和TFB1M。这些酶靶向不同的RNA种类：METTL3和METTL14协同作用将m6A沉积在mRNA上，ZCCHC4和METTL5修饰rRNA，TFB1M修饰线粒体rRNA，METTL4靶向microRNA，而METTL16甲基化U6小核RNA（snRNA）和MAT2A mRNA。m6A的去甲基化主要由FTO和ALKBH5完成（图1b–f）。
除了m6A之外，至少还鉴定了六种RNA甲基化类型。N5‑甲基胞嘧啶（m5C）由NSUN酶和DNMT2（也称为TRDMT1）沉积，并由TET1和TET2去除。m1A主要存在于tRNA和rRNA中，由TRMTs和NML（也称为RRP8）催化，并由ALKBH1、ALKBH3和FTO去除。TRMT61B、TRMT6‑TRMT61A和TRMT10C将m1A添加到mRNA中，并由ALKBH3去除。m3C由METTL2A、METTL2B和METTL6添加到tRNA上，由METTL8添加到mRNA上。ALKBH1可以从mRNA中去除m3C。N7‑甲基鸟苷（m7G）存在于多种RNA中，包括mRNA（由RNMT甲基化）、tRNA（由METTL1甲基化）和18S rRNA（由WBSCR22甲基化）。CMTR1和CMTR2在mRNA的第一个和第二个转录核苷酸上添加2′‑O‑甲基化修饰，而纤维蛋白、TRMT13和HENMT1分别在mRNA、tRNA和Piwi互作RNA上添加2′‑O‑甲基化修饰。最后，N6,2′-O‑二甲基腺苷（m6Am）由PCIF1催化。并通过FTO从mRNA中去除。其他tRNA甲基化由多种TRMT酶催化（图1b–f）。
Rossmann折叠SAM结合位点和解旋酶ATP结合位点的结构表现出显著的相似性，两者都由β折叠两侧的α螺旋构成三层结构（补充图1d），确实一些SAM依赖性甲基转移酶也能结合并水解ATP。RNA解旋酶的许多特征，包括具有核苷衍生的配体以及RNA、SBM配体和蛋白质结构之间的三向相互作用，都反映了SBM调控的RNA结合蛋白的共同特征。在METTL3-METTL14异二聚体和DDX3X同二聚体，RNA结合在Rossmann折叠界面形成的裂隙内，RecA结构域和配体结合分别调节该裂隙的形状。相比之下，双加氧酶采用独特的果冻卷结构，其中包含一个可容纳α‑酮戊二酸和离子配体的口袋。尽管存在这些结构差异，但双加氧酶中配体和底物结合仍然相互关联：α‑酮戊二酸增强AlkB对底物的亲和力并稳定其构象，而分子动力学分析表明，RNA与FTO的结合会将α‑酮戊二酸重新定位到活性位点，从而促进催化。甲基转移酶和双加氧酶与RNA和配体结合的晶体结构显示，环状结构能够夹住RNA，引导其沿着球状结构域外表面靠近配体的带正电荷的沟槽移动，接触范围延伸至多个碱基（补充图1d）。
与细胞中含量始终丰富的ATP不同，SAM的水平（平均~10 μM）会根据细胞状态发生显著波动（10倍至100倍）。SAM的合成本身也受到MAT2A mRNA甲基化的调控，MAT2A mRNA编码一种关键的SAM合成酶，这是维持SAM稳态的反馈回路的一部分。甲基转移酶-SAM结合与RNA识别之间的相互作用在不同酶之间存在差异。例如，METTL3-METTL14异二聚体（补充图1d）首先与SAM结合，这会诱导构象变化，从而使其能够结合RNA（图2a）。相比之下，METTL16首先与U6 snRNA结合，然后再与SAM结合，但它与其他靶标的相互作用方式各不相同。值得注意的是，METTL16具有较高的RNA结合亲和力（纳摩尔级），但对SAM的亲和力却低得多（126 μM），这使得其活性对细胞内SAM水平更加敏感。类似地，α-酮戊二酸结合的RBPs也会对配体和抑制性代谢物浓度的生理波动做出反应。尽管细胞内α-酮戊二酸的水平通常在数百微摩尔范围内，并且FTO与其结合的解离常数（Kd）值为4 μM——这表明其通常不敏感——但在某些情况下，2-羟基戊二酸水平升高可以有效地与α-酮戊二酸竞争并抑制FTO的活性。在体外，其他代谢物，例如富马酸、琥珀酸和柠檬酸，可以拮抗α-酮戊二酸依赖性脱甲基酶，包括FTO和ALKBH5，尽管有效的抑制通常需要高浓度。
其他RNA修饰因子
除了甲基化之外，RNA还可以进行多种其他修饰。例如，二氢尿苷（DHU）由DUSs和DUS样酶（DUSLs）引入tRNA，从而促进tRNA的结构适应。DUS1L以NAD(P)H为辅因子，将尿苷还原为二氢尿苷。同样，MTO1以FAD为配体，催化线粒体tRNA中的5‑牛磺酸甲基尿苷修饰（τm5U）（图1c）。乙酰辅酶A作为NAT10依赖的N4‑乙酰胞苷（ac4C）修饰的辅因子，修饰rRNA、tRNA和mRNA（图1b‑d）。糖残基（Gly）分别由喹诺⾟‑tRNA半乳糖基转移酶和tRNA‑喹诺⾟α‑甘露糖基转移酶添加到tRNA上，它们分别利用核苷酸糖尿苷二磷酸（UDP）‑半乳糖和GDP‑甘露糖（图1c）。有趣的是，2′,3′‑环核苷酸3′‑磷酸二酯酶是一种在神经系统中含量丰富的膜相关酶，它利用NADP+催化2′,3′‑环核苷酸转化为未修饰的核苷酸。这种不寻常的酶活性的生理意义尚不清楚。最后，无模板RNA聚合酶如poly(A)聚合酶、poly(U)聚合酶、CCA添加酶（图1c）和2′‑5′‑寡腺苷酸合成酶，作为其酶促功能的一部分，与核苷酸结合。
结合GTP的RBPs
GTP被RBPs利用，包括翻译因子关联（TRAFAC）家族的GTP酶成员，例如延伸因子Tu（EF‑Tu）、EF‑G和Obg家族。EF‑Tu的GTP结合域是一种Rossmann折叠结构，存在于17种人类蛋白质中。该结构域促进氨酰tRNA递送至核糖体，并在正确识别密码子‑反密码子后水解GTP。在TRAFAC类中，Obg超家族包含多种GTP结合蛋白（GTPBPs）和发育调控GTP结合蛋白（DRGs），它们在翻译和核糖体生物合成中发挥着不同的作用（图2a）。值得注意的是，GTPBP10和GTPBP5是Obg家族蛋白的两个人类同源物，它们参与线粒体核糖体生物合成，而一些Obg蛋白，如OLA1，可以增强富含D/E的mRNA的翻译效率。
其他结合小分子的RBPs
除了解旋酶之外，还报道了其他一些能结合ATP的RBPs。异质核糖核蛋白U（HNRNPU）中含有AAA+ ATPase结构域，据报道该蛋白能结合并水解ATP。ATP结合促进HNRNPU寡聚化（图2b），这可能促进染色质‑新生RNA复合物的结构变化。线粒体蛋白酶LONP1也与ATP结合，从而抑制其与RNA的相互作用（图2a）。
越来越多的RBPs被发现可以与糖或糖衍生物结合（图2）。例如，HuR（也称为ELAVL1）可以与UDP-葡萄糖结合，并与RNA结合存在竞争关系。果糖-6-磷酸（F6P）与真核翻译起始因子2B亚基-α（eIF2Bα）结合可以增强其二聚化，从而激活eIF2B复合物。研究表明，葡萄糖也可以与NSUN2、DDX21和DDX50结合。葡萄糖结合可以增强NSUN2的SAM结合亲和力、寡聚化和酶活性。相比之下，葡萄糖在DDX21和DDX50中与ATP结合存在竞争关系，导致二聚体解离。虽然超出本文综述的范围，但RBPs也可以发生糖基化。例如，有报道称RBP核磷蛋白会发生糖基化并重新定位到细胞表面。
其他代谢调节剂包括油酸，它直接与MSI1的RNA识别基序（RRM）相互作用，变构抑制其RNA结合活性；以及L‑脯氨酸，它通过与NONO的第二个RRM结构域结合来稳定NONO二聚化（图2）。
小分子代谢物（SBMs）与RNA结合蛋白（RBPs）之间的相互作用比之前认为的更为普遍，这引发了一个问题：究竟存在多少SBM-RBP相互作用？许多细胞代谢物的细胞内浓度很高，包括乳酸（在各种组织中浓度为1.5–40 mM）、ATP（1–10 mM）和神经递质谷氨酸（在星形胶质细胞和神经元中浓度为10–100 mM）。在这些浓度下，即使代谢物的亲和力较弱，解离常数在微摩尔级别（对应于结合自由能约为-4.5 kcal mol⁻¹）也可能具有重要的功能意义。SBMs相对于其蛋白质伴侣的丰度表明，许多其他RBPs可能持续与小分子相互作用，从而动态调节RNA代谢以响应代谢波动。
小分子结合RBPs的功能
ATP、GTP、SAM和乙酰辅酶A等小分子可以通过改变RBPs的构象、RNA结合亲和力、酶活性和亚细胞定位来影响这些蛋白。因此，这些小分子有助于通过液-液相分离形成生物分子凝聚体，并影响RNA的定位、加工和翻译。
凝聚体（Condensate）的形成和功能
细胞含有多种富含蛋白质和RNA的凝聚体，包括核仁（nucleoli）、核斑点（nuclear speckles）、应激颗粒（stress granules）和加工小体（processing bodies）。这些细胞区室是通过液-液相分离形成的，这种现象发生在分子由于移动性、高浓度和优先相互作用等因素而分离成不同相时——而RNA和RBPs就具备这些条件。应激颗粒由Ras GTP酶激活蛋白结合蛋白1（G3BP1）及其相关蛋白标记，并富含poly(A) RNA，在翻译抑制条件下形成。尽管应激颗粒的确切功能尚未完全阐明，但它们的形成受保守的分子原理调控。新出现的证据表明，RNA修饰有助于应激颗粒的组装。例如，m6A及其写入酶METTL3可能介导RNA在应激颗粒中的富集（图3）。此外，m6A甲基化的mRNA与YTH家族m6A阅读蛋白结合，这些复合物会分配到各种内源性无膜区室中，包括应激颗粒和核斑。另外，NAT10依赖的ac4C沉积已被证明可以增强RNA向应激颗粒的分配。有趣的是，核仁蛋白58在NAT10依赖的条件下易位到应激颗粒中。这种依赖性方式突显了核仁和应激颗粒之间潜在的相互作用（图3）。值得注意的是，生理水平的游离ATP可通过ATP与蛋白质外部特定氨基酸的接触在体外溶解RBP凝聚体，这表明ATP在体内将细胞能量状态与凝聚体形成联系起来方面发挥作用。
RNA定位
SBMs通过与RBPs相互作用调控RNA定位，从而通过甲基化和解旋酶活性促进mRNA从细胞核输出。SAM促进细胞核内mRNA的甲基化，包括m7G、m6A、m5C和m1A，这些甲基化均有助于mRNA的核输出（图3）。mRNA 5′端共转录添加的m7G帽结构特征明确，它通过连接帽结合复合物和转录‑输出（TREX）复合物来促进mRNA的输出。DDX39B（UAP56）是TREX中的一种ATP依赖性解旋酶，它能解开RNA使其与ALYREF（也称为THOC4）结合，从而促进RNA的输出。在核孔的胞质端，DDX19通过其SBM上的六磷酸肌醇（IP6）与mRNA输出因子GLE1结合，从而促进解旋酶活性，驱动RNA输出到胞质（图3）。然而，IP6在RBP和/或RNA调控中的功能目前尚不明确。
多种解旋酶以ATP结合和解旋酶活性依赖的方式调节RNA在应激颗粒中的定位（图3）。eIF4A在翻译起始期间解开mRNA 5′非翻译区（5′ UTR）中的结构，从而抑制应激颗粒的组装。类似地，DHX36可解开5′ UTR RNA，抑制DHX36可降低翻译并增加应激颗粒的定位。相反，DDX3可促进应激颗粒的形成，这可能是通过与其他RBPs相互作用实现的，而靶向其ATP结合位点或RNA结合位点的抑制剂可以抑制这种作用。
mRNA加工
mRNA的加帽、加尾、剪接和降解均由SBM结合的RBPs介导（图3）。Poly(A)聚合酶利用ATP添加聚腺苷酸尾，而RNA甲基转移酶（RNMT）以SAM为辅因子催化5′端加帽。ATP对于剪接体的组装和催化至关重要，驱动关键的剪接转换。例如，结合ATP的PRP28（一种DEAD-box RNA解旋酶）重塑5′剪接位点的RNA，以确保剪接的准确性。类似地，DHX38水解ATP，使3′剪接位点能够正确定位，从而实现外显子‑外显子连接。SAM结合的METTL16催化3′剪接位点的m6A修饰，从而阻断剪接因子U2AF35对该位点的识别，抑制前体mRNA的剪接。相反，SAM结合的METTL3在5′UTR中沉积m6A，进而募集YTH蛋白和剪接因子来调控前体mRNA的加工。类似地，由SAM结合的NSUN2在RNA中沉积的m5C能够募集富含丝氨酸/精氨酸的剪接因子2进行前体mRNA的剪接。其他RNA修饰，包括m7G和m1A，也参与前体mRNA的剪接。此外，葡萄糖与DDX21的结合促进其组装成剪接因子复合物，从而影响组织分化过程中的前体mRNA剪接。
SBMs还通过调节RBPs来调控RNA稳定性。RNA解旋酶在RNA降解中起着关键作用；例如，ATP依赖性解旋酶MTR4（也称为DExH9）招募RNA外切体复合物进行解旋酶驱动的RNA降解，而UPF1利用ATP水解来重塑RNA-蛋白质复合物并促进无义介导的mRNA降解（nonsense-mediated mRNA decay，NMD）（图 3）。除了解旋酶之外，RBP HuR通过与三四脯氨酸相互作用来阻止mRNA降解，从而稳定mRNA。然而，UDP-葡萄糖与HuR的结合会抑制HuR与SNAI1 mRNA的结合，从而触发其降解。此外，SAM依赖性m6A、m1A和内部m7G修饰会促进NMD，而帽式m7G和m5C修饰则增强mRNA稳定性。最后，葡萄糖与DDX50的结合会增强其与双链RNA结合蛋白Staufen同源物1（STAU1）的相互作用，从而抑制UPF1–STAU1 NMD复合物的形成。反过来，DDX50的缺失会导致角质形成细胞分化过程中RNA的不稳定。
RNA翻译
SBMs通过与RBPs结合来调节翻译，从而影响核糖体募集、翻译起始和延伸（图3）。ATP依赖性DEAD-box解旋酶，例如eIF4A、DHX36和DDX3，能够重塑RNA结构，从而在起始阶段增强核糖体与mRNA的结合。EF‑Tu将氨酰tRNA递送至核糖体A位点，而EF‑G则驱动核糖体沿mRNA的易位，二者均由GTP水解驱动。SAM结合甲基转移酶介导RNA修饰，例如mRNA中的加帽和内部m7G修饰，编码序列中的m6A修饰以及tRNA中的m1A修饰，所有这些修饰均能提高翻译效率。此外，葡萄糖与NSUN2结合，从而促进其与翻译复合物的结合，进而提高翻译效率（图3）。
疾病中的小生物分子‑RBP相互作用
鉴于SBM‑RBP相互作用在RNA加工中起着至关重要的作用，它们的失调与多种疾病有关，包括癌症、神经退行性疾病、代谢性疾病和组织分化异常。
癌症
RNA解旋酶在多种癌症中经常发生突变，导致mRNA加工失调和细胞异常生长（图4a）。ATP结合在这一调控过程中起着至关重要的作用。例如，DDX3X既具有抑癌功能，也具有致癌功能。对儿童髓母细胞瘤中DDX3X突变的晶体学表征发现，其N端存在一个不同于经典ATP结合域的新型ATP结合环，该环介导ATP水解。这一发现强调了ATP结合完整性对于肿瘤发生过程中解旋酶活性的必要性。同样，编码RNA解旋酶的DDX41的种系突变与家族性急性髓系白⾎病（AML）有关，而AML中的体细胞突变通常发生在ATP结合域，这可能导致功能减弱效应。
其他SBMs通过与RNA甲基转移酶和去甲基酶结合，在癌症中发挥关键作用（图4a）。METTL3介导的m6A甲基化具有依赖于情景的抑癌和致癌功能。METTL3的缺失会降低m6A水平并促进肝细胞癌和胃癌。相反，METTL3活性升高会促进癌基因转录本（如EGFR、STAT5和MYC）的稳定性或翻译，从而增强肿瘤发生。同样，FTO也表现出依赖于特定环境的抑癌和致癌功能。FTO通过与α‑酮戊二酸结合，使包括KRAS、MYC和STAT3在内的癌基因转录本去甲基化，从而调节其在十多种癌症中的稳定性和翻译。m5C甲基转移酶NSUN2可作为癌症预后标志物。m5C的高甲基化可稳定癌基因转录本，例如膀胱癌中的HDGF mRNA和肝细胞癌中的H19长链非编码RNA。NSUN2驱动的m5C甲基化激活肝细胞癌和食管癌中的致癌WNT、PI3K–AKT和ERK–MAPK通路。此外，葡萄糖结合促进NSUN2寡聚化，从而增强mRNA甲基化和肿瘤发生，并驱动免疫治疗耐药性。
在癌症中，SBMs可直接与其他RBPs相互作用并调控它们（图4a）。已知能稳定富含AU的mRNA的RBP HuR与癌症进展相关。UDP‑葡萄糖与HuR的结合会抑制其与上皮‑间质转化相关SNAI1 mRNA的结合，导致SNAI1 mRNA降解并减少肺癌转移。然而，EGFR介导的UDP‑葡萄糖6-脱氢酶Tyr473位点的磷酸化激活了该酶将UDP‑葡萄糖转化为UDP‑葡萄糖醛酸的活性，从而逆转了这种抑制作用，这与转移复发和肺癌预后不良相关。总的来说，这些发现突显了多效性作用SBM‑RBP在癌症中的相互作用。
神经退行性疾病
大脑需要对RNA加工进行精确的转录后调控，以调节基因的时空表达，这一过程高度依赖于RBPs。RBPs失调长期以来被认为与神经退行性疾病有关，而近期的全基因组关联研究进一步将RBPs变异与精神疾病联系起来。
TDP43是hnRNP家族的成员，在RNA加工中起着至关重要的作用，包括转录、剪接、运输和稳定性。TDP43的病理性聚集是肌萎缩侧索硬化症和额颞叶痴呆等神经退行性疾病的标志性特征。TDP43的功能性寡聚化可对抗病理性聚集，而ATP与N端结构域的结合可增强功能性寡聚化并减少聚集（图4）。然而，与ALS相关的D169G突变会破坏ATP结合，从而促进聚集和疾病发生。鉴于较高的ATP水平可减少蛋白质聚集，ATP耗竭会促进TDP43聚集，且ATP水平下降在神经退行性疾病中很常见，因此，调节ATP水平或开发能增强ATP与TDP43相互作用的小分子模拟物可能有助于治疗ALS，对神经退行性疾病具有治疗意义。
eIF2B是一种参与翻译起始过程的必需GTP结合蛋白，在罕见的神经系统疾病——白质消失症中发生突变。除了GTP之外，eIF2B还能结合糖磷酸酯，例如F6P，这些糖磷酸酯可以变构增强翻译效率（图4b）。与白质消失症相关的eIF2Bα(N208Y) 突变体无法结合糖磷酸酯；相比之下，F6P可以恢复eIF2Bα(V183F)突变体的活性，该突变体虽然破坏了二聚体形成，但仍保留了糖磷酸酯结合能力。这些发现表明，糖磷酸酯结合能够促进eIF2B复合物的形成和翻译（图4b）。这些发现强调了SBM-eIF2B相互作用对于mRNA翻译的重要性及其与白质消失症的相关性。
代谢紊乱
全基因组关联研究表明，多种RBPs与代谢性疾病相关。FTO是最早被发现与2型糖尿病⻛险增加相关的基因之一。FTO后来被鉴定为一种m6A去甲基酶，在包括肝脏、下丘脑、骨骼肌和脂肪组织在内的多种组织中表达。近期研究发现，NAD(P)H是与FTO具有高亲和力结合的代谢产物。值得注意的是，NAD(P)H特异性地与FTO结合，并增强其去甲基酶活性（对去甲基酶ALKBH5的影响甚微）。高脂饮食引起的NADPH水平升高导致了FTO依赖性的脂肪生成（图4c）。
除了代谢物外，非必需氨基酸（在2型糖尿病患者中通常升高）也可能在⾎糖升高中发挥致病作用。由RBPs NONO‑SFPQ‑PSPC1复合物与NEAT1长链非编码RNA（lncRNA）和靶mRNA结合形成的paraspeckles通过多种机制调控基因表达。结构研究表明，L‑脯氨酸通过结合NONO的RRM2结构域来稳定NONO二聚体，这可能干扰RNA相互作用（图4c）。最近一项在糖尿病小鼠模型中的研究表明，肝细胞中L‑脯氨酸水平升高会降低NONO与NEAT1的结合，从而导致NEAT1降解和paraspeckles形成受损。因此，Ppargc1a和Foxo1等mRNA被释放到细胞质中，导致蛋白质表达增加，从而增强糖异生和高⾎糖（图4c）。值得注意的是，在这些小鼠中恢复paraspeckles的形成可以改善高⾎糖，这表明L‑脯氨酸调控可能是一种潜在的糖尿病治疗策略。
组织分化异常
研究表明，葡萄糖水平升高是驱动组织特异性分化的RBPs的关键调节因子。例如，葡萄糖与DDX21（一种对表皮分化至关重要的RNA解旋酶）结合并取代ATP，导致DDX21解聚并从核仁重新定位到核质中的剪接相关复合物，从而促进分化相关剪接。类似地，葡萄糖与ATP竞争结合DDX50（一种相关的解旋酶），改变其多聚化状态并促进其与STAU1的相互作用，STAU1可在转录后水平稳定促分化转录物（图4d）。另一个有趣的ATP-葡萄糖开关调节DDX21和DDX50，并影响组织分化。在增殖细胞中，ATP水平较高，这些DDX蛋白与ATP结合并参与RNA解旋。然而，随着分化的进行，ATP水平下降，葡萄糖水平升高，DDX21和DDX50转而与葡萄糖结合，从而将其功能转向RNA剪接或稳定。此外，葡萄糖通过促进NSUN2（一种对表皮分化至关重要的甲基转移酶）与SAM的结合来增强其活性，从而促进mRNA翻译。
脂肪酸介导的RBPs调控对于神经和上皮谱系干细胞的功能至关重要。MSI1结合并稳定硬脂酰辅酶A去饱和酶（SCD或SCD1）的mRNA，该mRNA编码一种将硬脂酸转化为油酸的酶，并与细胞增殖相关。反过来，油酸直接结合MSI1的RNA结合域（RRM），并变构抑制其RNA结合活性，这表明存在一个反馈回路，其中MSI1作为脂肪酸传感器，将脂肪酸代谢与干细胞增殖和分化联系起来。值得注意的是，MSI1失调导致的异常细胞增殖与多种癌症相关。
RNA结合蛋白的小分子生物抑制剂
RBP抑制剂是治疗由RBP功能失调引起的疾病（包括癌症和神经退行性疾病）的潜在有效药物。迄今为止，已开发出70多种特性明确的小分子，可直接靶向26种经典的RBPs。这些抑制剂包括RNA甲基化读取蛋白抑制剂，例如IGF2BP1和YTHDFs；写入蛋白抑制剂，例如METTL3、METTL16、NSUN2、NSUN3和NSUN6；以及擦除蛋白抑制剂，例如FTO和ALKBH5。此外，还开发了针对RNA解旋酶的小分子，包括G3BP1、eIF4E、eIF4A、DDX3、DDX5以及DHX9；并针对一系列与疾病相关的RBPs，包括HuR、LIN28、TDP43、SF3B1、HNRNPA18、RBM39、TARBP2、PUM1、XPO1、MSI2和ZC3H14。
这些抑制剂能够调节RNA代谢的多个方面。例如，靶向FTO、eIF4E和SF3B1的小分子已在急性髓系白⾎病（AML）等癌症中展现出治疗潜力。它们分别通过干扰mRNA去甲基化、帽依赖性翻译和前体mRNA剪接发挥作用。在神经退行性疾病中，抑制TDP43的化合物正被研究用于减轻肌萎缩侧索硬化症和额颞叶痴呆相关的RNA毒性。最近，一种将靶向蛋白质的SBM与募集E3泛素连接酶的小分子连接的蛋白水解靶向嵌合体（PROTAC）系统已被用作RBP抑制剂，以诱导RBP降解。例如，靶向METTL3-METTL14复合物的PROTAC WD6305显示出作为AML潜在治疗药物的潜力。越来越多的RBP靶向化合物正在推进临床开发，其中一些已经获得FDA批准用于治疗，这凸显了靶向RBPs的SBMs在人类疾病中日益增长的转化潜力。
研究小生物分子‑RNA结合蛋白相互作用的方法
SBM‑RBP相互作用的动态特性要求采用整合生物化学、生物物理和细胞学技术的综合方法来对其进行表征。本节将讨论用于研究SBM‑RBP相互作用的方法。
基于质谱的方法
基于质谱的多组学方法，包括蛋白质组学和代谢组学，已被广泛用于研究SBM-蛋白质相互作用，包括SBM-RBP相互作用。传统的化学蛋白质组学技术用于鉴定SBM结合蛋白，通常包括SBM下拉实验，然后进行液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析。常见的下拉技术包括柱富集、基于生物素探针的亲和纯化和基于点击化学的捕获。例如，葡聚糖柱已成功用于富集葡萄糖结合蛋白，揭示RBP可以与葡萄糖相互作用。使用固定化激酶抑制剂鉴定激酶的激酶组亲和beads的成功应用表明，靶向RBP的SBM也可以以类似的方式使用。基于生物素的探针已被广泛用于捕获SBM结合蛋白，包括ATP、AMP、溶血磷脂酸和葡萄糖。这些基于亲和力的下拉方法始终表明，在富集的蛋白质中，RBP占有很高的比例。具体而言，对脱硫生物素修饰肽的筛选可以通过化学蛋白质组学鉴定SBM结合位点并发现基序。基于点击化学的下拉技术也已应用于鉴定与葡萄糖、UDP-葡萄糖和其他SBM相互作用的蛋白质，进一步证明RBP参与这些SBM相互作用。此外，还开发了新的标记平台，用于基于化学蛋白质组学的SBM结合蛋白靶点鉴定，例如全功能化片段探针和电亲和标记，扩展了未来研究SBM-RBP相互作用的可能性。
利用生物素连接酶（例如BirA、BASU、APEX或Turbo）进行邻近标记已被广泛应用于研究蛋白质‑蛋白质、蛋白质‑RNA和蛋白质‑DNA相互作用。在此基础上，一种名为生物素靶向嵌合体（biotin targeting chimera，BioTAC）的方法被开发出来，用于精确绘制小分子相互作用组图谱。BioTAC使用由目标化合物与选择性FKBP12(F36V) 募集剂orthoAP1867连接而成的双功能分子。这种设计使得可与配体结合的邻近标记酶(miniTurbo‑FKBP12F36V)能够募集到化合物结合的复合物上，从而促进其生物素化和后续的亲和纯化。这种基于邻近标记的方法能够捕获活细胞中瞬时结合SBM的蛋白质和复合物。
热蛋白质组分析（Thermal proteome profiling，TPP），也称为细胞热位移分析结合质谱（CETSA‑MS），已被用于研究SBM结合蛋白，例如ATP结合蛋白和蛋白抑制剂。有趣的是，RBP始终位列富集蛋白之列。TPP的高通量改进方法，例如蛋白质组整体溶解度改变（PISA）和药物亲和力响应靶标稳定性（DARTS），进一步拓展了我们研究SBM‑蛋白质相互作用的能力，并在多项研究中一致地将RBPs鉴定为关键组分。
有限蛋白水解（LiP）与质谱联用技术，于2017年以LiP小分子图谱（LiP-SMap）的形式报道，已被证明对代谢物‑RBP相互作用网络以及SBM结合位点的鉴定具有重要价值。其他基于LiP的技术，如肽中心局部稳定性分析（PELSA），在目标蛋白质鉴定方面具有极高的灵敏度，同时还能提供结合区域信息。
其他化学蛋白质组学技术利用整体氨基酸反应性来分析SBM的结合蛋白，同时精确定位结合位点。例如，NHS-炔基点击化学和碘乙酰胺-脱硫生物素（IA-DTB）等策略利用链霉亲和素富集来评估SBM处理下赖氨酸和半胱氨酸的可及性。半胱氨酸蛋白质组学技术，包括半胱氨酸反应性磷酸标签（CPTs）结合固定化金属亲和色谱（IMAC），最初是为鉴定金属离子结合蛋白而设计的，有望用于SBM结合研究。类似地，同位素串联正交蛋白水解活性分析（isoTOP-ABPP）已被应用于反应性半胱氨酸和赖氨酸，从而能够定量测定结合位点。或者，靶标响应可及性分析（TRAP）（使用同位素标记的甲醛进行赖氨酸甲基化）和蛋白质氧化速率稳定性（SPROX）测定（监测甲硫氨酸氧化动力学）这两种方法均不需要富集，可简化SBM-蛋白质相互作用的分析。
除了蛋白质组学之外，代谢组学方法也被用于鉴定SBM‑蛋白质相互作用。例如，一种基于亲和蛋白纯化和质谱的检测方法已被开发用于大规模鉴定蛋白质‑疏水性小分子代谢物相互作用。质谱与平衡透析相结合的系统性变构发现（MIDAS）方法通过评估代谢物在透析膜上的分布，实现了对代谢物‑蛋白质相互作用的系统性检测。尽管这两种方法尚未应用于SBM‑RBP相互作用的研究，但它们为未来的研究提供了有前景的方向。
利用蛋白质‑代谢物相互作用基于大小分离（PROMIS）对蛋白质‑代谢物相互作用进行全局分析，该方法结合了基于大小的分级分离、代谢组学和蛋白质组学。然而，由于相互作用网络基于共洗脱，因此需要正交验证方法来精确识别特定的蛋白质‑代谢物对。
体外试验
利用纯化的重组RBPs可以对SBM‑RBP相互作用进行体外表征。微尺度热泳（MST）、表面等离子体共振（SPR）、荧光偏振、等温滴定量热法（ITC）和电泳迁移率变动分析（EMSA）等技术已成功应用于定量结合亲和力（Kd）和评估相互作用特异性。包括核磁共振、X射线晶体衍射和冷冻电镜在内的结构生物学技术，能够提供高分辨率的SBM-RBP相互作用信息，为蛋白质结构和SBM的精确结合位点提供互补的视角。迄今为止，已解析出755个仅包含人类RBPs的PDB结构，其中293个结构包含SBM配体，这些结构至少使用了上述方法之一进行解析。
以RBP为中心的方法
传统的蛋白质-RNA结合检测技术，例如交联免疫沉淀（crosslinking and immunoprecipitation，CLIP），已被用于研究SBM-RBP相互作用，从而深入了解SBM诱导的RBP与RNA结合的变化。HITS-CLIP、PAR-CLIP、iCLIP、eCLIP、irCLIP和easyCLIP等方法利用紫外（UV）介导的交联将RBP共价连接到其RNA靶标上，随后进行免疫沉淀、酶解和高通量测序。结合SBM处理，CLIP已被用于鉴定改变的RBP-RNA结合位点，揭示小分子如何影响RNA-蛋白质相互作用。将CLIP与定量蛋白质组学相结合，可以进一步阐明SBM调控RNA上RBP组装的分子机制。或者，可以通过体外转录（使用生物素化的核苷酸或酶促标记）将RNA标记上生物素，从而选择性地捕获RNA-蛋白质复合物，以便通过质谱或蛋白质印迹法进行分析，无论是否使用SBM。基于邻近性的质谱技术，例如RNA-蛋白质相互作用检测（RaPID），也可用于研究SBMs如何影响RNA-蛋白质相互作用。
计算方法
分子对接、分子动力学模拟、机器学习和人工智能（AI）驱动的预测等先进计算方法极大地促进了SBM‑RBP相互作用的研究。分子对接可以预测SBM在已通过实验解析结构和使用AlphaFold建模的RBP上的结合位点。该方法已被用于阐明HuR‑UDP‑葡萄糖相互作用的分子机制，并模拟葡萄糖与DDX21和DDX50的结合。分子动力学模拟提供了关于SBM‑RBP复合物的结合动力学、构象变化和稳定性随时间变化的深入见解。例如，分子动力学分析已识别出hnRNPA1中的配体结合口袋，从而指导了配体筛选研究。此外，基于现有结构和结合亲和力数据训练的人工智能和深度学习模型能够预测新的SBM‑蛋白质相互作用，并优化SBM以提高其特异性。这些计算方法加速了调控RBP功能的SBM的发现和设计，从而促进了治疗药物的开发和基础RNA生物学研究。
其他方法
基于荧光的检测方法是可视化和分析SBM‑蛋白质相互作用的有力工具。例如，活细胞成像技术能够研究SBM‑RBP在天然细胞环境中的相互作用。双光子荧光各向异性成像技术此前已被用于测量活细胞中药物‑靶点结合情况，也可应用于研究SBM-RBP相互作用。将水溶性和细胞膜渗透性荧光团（例如ORFluor染料）连接到SBMs上，有助于对这些相互作用进行定量活细胞成像。此外，代谢物亲和力响应靶标荧光猝灭（MARTFQ）检测方法已被广泛用于筛选SBM‑RBP相互作用，并发现了新的相互作用。
技术挑战
鉴定特定的SBM‑RBP相互作用仍然是一项相当大的挑战。与底物明确的酶不同，RBPs识别多种多样的RNA序列和结构，这增加了对其研究的复杂性。许多SBMs表现出低亲和力或瞬时相互作用，使得传统的生化和结构方法难以检测它们。某些SBMs固有的不稳定性进一步增加了鉴定其结合蛋白的难度。RBPs功能和结合基序的重叠导致其冗余性，使得选择性靶向变得复杂。在细胞中，与内源性配体的竞争以及翻译后修饰会影响SBM的结合，从而引入额外的变异性。整合蛋白质组学、结构生物学和计算建模等先进技术，可以精确绘制SBM‑RBP相互作用图谱，从而缓解这些挑战。
结论与展望
SBMs对RBPs的调控是一个新兴领域，对转录后基因调控具有深远意义。靶向SBM‑RBP相互作用为癌症、神经退行性疾病、RBP活性失调的代谢性疾病以及组织分化异常等疾病提供了有前景的治疗途径。然而，这一快速发展的领域值得进一步探索，以发现更多机制和治疗机会。
尽管一些小分子结合基序已被鉴定，但仍有许多基序未知，这限制了我们对小分子结合基序如何调节蛋白质功能的理解。蛋白质ATP结合基序和GTP结合基序是研究最为深入的蛋白质结构域之一，其磷酸盐结合环（P-loop）内含有保守的GXXXXGK序列，该序列有助于核苷酸的识别和水解。然而，其他小分子的结合基序仍未得到充分研究。一种很有前景的方法是利用反应性配体‑脱硫生物素探针从消化的蛋白质组中富集SBM结合肽序列，从而鉴定潜在的结合位点。此外，有限的蛋白质组学分析和基于赖氨酸/半胱氨酸反应性的蛋白质组学方法能够识别配体结合后发生的结构变化，为定位新的结合基序提供了一种补充策略。这些方法与计算建模相结合，可能会扩展我们对SBM结合特异性的认识。
靶向RBPs是一种很有前景的疾病治疗策略。然而，由于毒性和靶向特异性有限等问题，开发靶向RBP的疗法面临着巨大的挑战。脱靶效应会加剧毒性，而且由于许多RBPs对基本的细胞功能至关重要，抑制它们可能会导致广泛的功能障碍或细胞死亡。为了应对这些挑战，一种可能的策略是寻找具有RBP结合潜力的现有化合物，从而加速治疗药物的研发并最大限度地降低毒性。特别是，重新利用已获临床批准的激酶抑制剂（其中许多是ATP竞争性分子）提供了一种极具吸引力且切实可行的方法。由于所有RNA解旋酶都具有ATP结合亲和力，且解旋酶活性失调与多种疾病相关，因此值得探索这些ATP竞争性激酶抑制剂是否也能与RBP结合并调节其活性。如果这些抑制剂被证实能有效靶向RBPs，它们就可以被迅速用于治疗RBP相关疾病，从而绕过药物发现的早期阶段，并显著缩短新疗法进入临床所需的时间。
总之，RBPs与SBMs之间直接相互作用这一新兴领域正在重塑我们对转录后基因调控和疾病发病机制的理解。传统上，RBPs被视为被动结合RNA或在结合后发生诱导契合的刚性支架，但越来越多的研究表明，RBPs是能够进行配体驱动构象循环的动态分子机器。超过14%的已注释人类RBPs已知与SBMs存在相互作用，揭示了从双加氧酶的细微重排到解旋酶的大规模构象变化等一系列响应。RBPs与丰富的细胞代谢物结合所需的能量相对较低，这表明还有更多RBPs与SBMs相互作用。持续的研究有望揭示先前未知的基因调控层面。这些发现可能为靶向治疗策略开辟新的途径，尤其是在RBPs功能失调驱动的疾病中。
Miao, W., Porter, D.F., Lopez-Pajares, V. et al. Regulation of RNA-binding proteins by small biomolecules. Nat Rev Mol Cell Biol (2025). https://doi.org/10.1038/s41580-025-00914-4
