本节概览：
1.在文章中找到 GEO accession number, 从NCBI获取数据SRR号
2.在linux中使用prefetch命令根据SRR号下载SRA文件
3.使用fasterq-dump/fastq-dump命令将SRA文件转为FASTQ格式，pigz软件多线程压缩（可选）
4.使用fastqc和multiqc进行测序数据的质控查看
5.使用trim-galore去除低质量碱基和接头
承接上节RNA-seq入门实战（零）：RNA-seq流程前的准备——Linux与R的环境创建
一、从NCBI获取数据SRR号
数据的文章来源：
Formative pluripotent stem cells show features of epiblast cells poised for gastrulation | Cell Research (nature.com)
在文章的Data availability 下找到 GEO accession number: GSE154290
进入NCBI官网搜索GSE154290，选择相应结果进入
找到Supplementary file 下的SRA Run Select选项
Common Fields下介绍了数据的基本信息，例如表中的PAIRED表示双端测序数据。此次实战选择勾选 Found 27 Items下的RNA_mESCs和RNA_EpiSCs各两个数据，再选中Select下的Selected选项，下载Accession List后复制数据的SRR号
二、SRA数据下载
1.创建并进入test项目文件夹，将SRR号粘贴导入idname文件
mkdir test ;cd test
cat > idname
SRR12207279
SRR12207280
SRR12207283
SRR12207284
^C
2.创建SRA数据下载的脚本文件
vim 00_prefetch.sh
主要利用了sra-tools中的 prefetch命令下载sra数据
#sh内容################################
echo -e "\n \n \n prefetch sra !!! \n \n \n "
date
mkdir -p ~/test/raw/sra/
cd ~/test/raw/sra/
pwd
cat ~/test/idname | while read id ; \
do
( prefetch -O ./ $id & )
done
3.后台挂起运行脚本，运行情况导入log_00日志文件
nohup bash 00_prefetch.sh >log_00 2>&1 &
查看一下系统任务运行情况和test项目下的文件结构
任务运行没问题，等待数据下载完毕，暂时去relax一下吧ヽ(￣▽￣)ﾉ
当cat log_00出现以下downloaded successfully字样时表示下载完成，再检查数据下载情况，确认下载完成没问题后就可以进行下一步文件格式转化啦
三、 SRA文件转为FASTQ格式
主要利用了sra-tool中的fasterq-dump命令转化格式为fastq，之后用pigz软件多线程压缩为.gz文件节省空间（可略过），再用fastqc和multiqc进行原始数据的质控和质控汇总~
同上，先创建 01_sra2fq_qc1.sh 脚本文件
vim 01_sra2fq_qc1.sh
###########################################
#移动sra子文件夹下的文件并删除子文件夹
date
echo -e "\n \n \n 111# move files !!! \n \n \n "
cd ~/test/raw/sra/
cat ~/test/idname | while read id
do
mv $id/* ./
rm -rf $id/
done
date
echo -e "\n \n \n 111# sra>>>fq !!! \n \n \n "
mkdir -p ~/test/raw/fq/
cd ~/test/raw/fq/
pwd
ls ~/test/raw/sra/*.sra |while read id
do
echo " PROCESS $(basename $id) "
fasterq-dump -3 -e 12 -O ./ $id
pigz -p 12 ~/test/raw/fq/*q
done
date
echo -e " \n \n \n 111# qc 1 !!! \n \n \n "
mkdir ~/test/raw/qc1/
cd ~/test/raw/qc1/
pwd
ls ~/test/raw/fq/* | xargs fastqc -t 12 -o ./
multiqc ./
echo -e " \n 111# ALL Work Done!!! \n "
date
运行01_sra2fq_qc1.sh 脚本文件
nohup bash 01_sra2fq_qc1.sh >log_01 2>&1 &
四、质控清洗
1. 原始数据质量查看
查看上一步qc1文件夹下的multiqc_report.html质控汇总网页文件，主要关注测序质量与测序接头这两项内容，可以发现该数据质量较好，平均质量均在30以上，接头含量也很低。
具体内容分析见：
20160410 测序分析——使用 FastQC 做质控 - 知乎 (zhihu.com)
小L生信学习日记-3丨原始数据质量如何判断？-上 (qq.com)
小L生信学习日记-4丨原始数据质量如何判断？-下 - 知乎 (zhihu.com)
2. 质控清洗数据
主要使用trim-galore去除低质量碱基和接头，详尽使用方法参见lncRNA组装流程的软件介绍之trim-galore
常用参数如下：
vim 2_cleanfq_qc2.sh
##############################################
echo -e " \n \n \n 222# Clean ! trim_galore !!! \n \n \n"
date
mkdir ~/test/clean/
cd ~/test/clean/
pwd
##########single###########################################################################
#ls ~/test/raw/fq/*.f* | while read id
#do
# trim_galore -q 25 -j 4 --phred33 --length 35 --stringency 3 \
# --gzip -o ~/test/clean/ $id
#done
#
##########paired###########################################################################
#1）先把文件_1、_2的路径文件名分别存储，再合并成两列的格式，存为config#########
ls ~/test/raw/fq/*_1* >1
ls ~/test/raw/fq/*_2* >2
paste 1 2 >config
cat config | while read id
do
arr=($id)
fq1=${arr[0]}
fq2=${arr[1]}
trim_galore -j 4 -q 25 --phred33 --length 35 --stringency 3 \
--paired --gzip -o ~/test/clean/ $fq1 $fq2
done
###########################################################################################
echo -e "\n \n \n 222# qc2 检查clean清洗结果!!! \n \n \n"
mkdir ~/test/clean/qc2
cd ~/test/clean/qc2
pwd
ls ~/test/clean/*f*.gz | xargs fastqc -t 12 -o ~/test/clean/qc2
multiqc ./
echo -e " \n 222# ALL Work Done !!! \n "
date
nohup bash 2_cleanfq_qc2.sh >log_2 2>&1 &
3. 清洗后数据质量查看
查看~/test/clean/qc2下的multiqc_report.html质控汇总网页文件，碱基质量更好一些了
到此，我们完成了RNAseq原始数据的下载、格式转化和质控清洗步骤，得到了经过质控后存放于clean文件夹下的fastq文件，接下来就可以利用这些cleaned fastq文件进行下一步的比对、计数（hisat2+feature_counts 或 salmon），最终得到我们想要的counts文件
参考资料
20160410 测序分析——使用 FastQC 做质控 - 知乎 (zhihu.com)
小L生信学习日记-3丨原始数据质量如何判断？-上 (qq.com)
小L生信学习日记-4丨原始数据质量如何判断？-下 - 知乎 (zhihu.com)
lncRNA组装流程的软件介绍之trim-galore
本实战教程基于以下生信技能树分享的视频：
【生信技能树】转录组测序数据分析_哔哩哔哩_bilibili
【生信技能树】GEO数据库挖掘_哔哩哔哩_bilibili
RNA-seq实战系列文章：
RNA-seq入门实战（零）：RNA-seq流程前的准备——Linux与R的环境创建
RNA-seq入门实战（一）：上游数据下载、格式转化和质控清洗
RNA-seq入门实战（二）：上游数据的比对计数——Hisat2+ featureCounts 与 Salmon
RNA-seq入门实战（三）：从featureCounts与Salmon输出文件获取counts矩阵
RNA-seq入门实战（四）：差异分析前的准备——数据检查
RNA-seq入门实战（五）：差异分析——DESeq2 edgeR limma的使用与比较
RNA-seq入门实战（六）：GO、KEGG富集分析与enrichplot超全可视化攻略
RNA-seq入门实战（七）：GSEA——基因集富集分析
RNA-seq入门实战（八）：GSVA——基因集变异分析
RNA-seq入门实战（九）：PPI蛋白互作网络构建（上）——STRING数据库的使用
RNA-seq入门实战（十）：PPI蛋白互作网络构建（下）——Cytoscape软件的使用
RNA-seq入门实战（十一）：WGCNA加权基因共表达网络分析——关联基因模块与表型
