1.打开Primer3Plus在线网页（https://www.primer3plus.com/）进行设计引物；
2.输入序列（目的基因的CDS的核酸序列）；
输入序列
3.进行产物长度、引物大小等的设定（如图所示）
对产物长度(一般为80-150bp)、引物长度、退火温度及GC含量设定
4.点击pick primers后得到结果；
结果展示
5.利用DNAMAN检测引物是否存在发卡结构：打开DNAMAN软件，点击primer-Load primer-From Input，输入Forward引物；点击Primer-Two Primer Complementarity-Second primer From Input，即可查看引物能否形成发卡结构。
检测结果（一般选择少于四个发卡结构的引物）
6。满足条件的即可确定为比较好的qPCR引物，发送至公司邮箱合成即可。
这只是设计qPCR引物的其中一种方法，大家可以选择自己熟悉的方法进行设计。
