Week 31: 2018— 12.10-12.15
Title: Analysis of allelic expression patterns in clonal somatic cells by single-cell RNA-seq
DOI (url) :10.1038/ng.3678
Public Date：26 September 2016
Journal：Nature Genetics
Key word：clonal aRME，sc-RNA-seq

在二倍体生物中，等位基因的不均等表达或者说只有一个等位基因表达的模式可形成细胞的异质性。这一观点在前面几篇文章中简单进行了介绍，

• Week28 — 单细胞RNA-seq揭示哺乳动物细胞中动态的、随机的单基因表达
• Week29: 利用单细胞技术揭示人类胚胎植入前谱系发育和X染色体的动态变化
• Week30 — 常染色体单等位基因的随机表达

但是关于这个观点仍存在争论，有很多问题还是不明确，如体细胞常染色体的单等位基因表达模式是否存在通过有丝分裂遗传（即克隆），如果存在有多大比例？
这篇文章用sc-RNA-seq技术以克隆的原代小鼠成纤维细胞和新鲜的人CD8+ T细胞作为细胞模型，探究单等位基因的克隆（clonal aRME）和动态(dynamic aRME)表达模式。这篇文章的结果中他们虽然检测到了clonal aRME，但是这种模式却非常少，只在<1%的基因检测到了，而且主要影响表达非常弱的基因。因此认为大部分aRME在单细胞中是短暂出现的，分散在体细胞群，而不是局限在克隆相关的斑块。

几个重要的概念：

• Random monoallelic expression (RME)：随机单等位基因表达，指单等位基因的表达具有随机性
• autosomal RME (aRME)： 常染色体的随机单等位基因，包含两种模式
  1）clonal/fixed aRME ; 2) dynamic aRME
• clonal aRME：
  clonal aRME也称为fixed aRME，指单基因特异表达的模式在分裂后的子细胞间是保守的，是通过有丝分裂传播的，只能在克隆相关细胞中研究。

• dynamic aRME
  dynamic aRME指单基因表达模式是短暂的，传播不是必需通过有丝分裂，需要单细胞水平上研究。

  
  
  clonal/fixed aRME & dynamic aRME

主要结果：

1. 小鼠原代成纤维细胞中的aRME大部分是dynamic 的表达模式

随机选取单个成纤维细胞或单克隆扩增后用Smart-seq2进行单细胞转录组测序，最终选取了7个克隆（图a）。总共检测到10,702个基因表达（RPKM>1)，有82%的基因具有菌株特异性的SNPs。然后用这些SNPs他们鉴定到每个基因的表达模式是作为双等位基因表达，还是母本单等位基因或父本单等位基因表达亦或者是没有在细胞中检测到。
接下来他们用RPKM>20的阈值鉴定aRME（文章中还说这个阈值决定了dynamic aRME rates，不明白为什么选择这个阈值，还说这个阈值可以确定dynamic aRME rates）,观测到成纤维细胞中常染色体基因有13%（平均值）是单等位基因表达（图b）。
然后就是确定aRME是clonal 还是dynamic模式。若是clonal aRME模式的，那么也就是说单等位基因的表达在克隆细胞中是一样的，同时要排除印记基因和染色体变异的情况。他们的数据结果显示dynamic aRME在原代成纤维细胞中占aRME的95%,在RPKM>20的表达基因中，他们检测到clonal aRME（图e）。

2. clonal aRME表达模式稀有，且多出现在低表达基因中

为了鉴定clonal aRME他们设计了“gene-level test”，最终在两个克隆中发现clonal aRME分别占0.45%和0.57%（图c/d）。这个过程他们以印记基因的检测做为阳性对照。另外他们发现具有clonal aRME的这些基因表达水平低,每个细胞中约2RNA拷贝（中值）（图e)。clonal aRME没有呈现出剂量补偿效应，因为clonal aRME倾向于非克隆群中产生一半的转录本，clonal aRME的基因和非克隆细胞中单等位基因具有相等的转录产出（图f）。

3. 人类T细胞中的dynamic 和clonal aRME

接下来他们第一次在体内的一个体细胞类型中确定了dynamic aRME和clonal aRME的普遍性。
一个接种了黄热病疫苗的男性捐赠者，血液样本在第15天（急性期）和136天(记忆期）收集（图a）。他们发现收集的T细胞中aRME在记忆时期的比例更大（图b），但是T细胞中clonal aRME的比例仍然很低（图c）。他们的“gene-level test”发现了一小部分具有clonal aRME的基因，尤其是KLRB1在不同克隆中出现的等位基因不平衡(图d)。
即使在单等位基因表达水平高的T细胞中，大多数aRME依然是动态的，只有稀少的clonal aRME。

4. 细胞大小和细胞周期会影响dynamic aRME的程度

为了确定什么因素影响dynamic aRME，他们提出假设在大的细胞中增强转录速率可能导致dynamic aRME的降低。然后他们选取直径不一样的大小成纤维细胞进行实验和测序分析，发现大细胞包含更多的ploy A RNA, 与小细胞相比具有更低程度的aRME（图a,b,c）。然后他们观察到dynamic aRME与细胞周期的关系，发现在G0期，dynamic aRME是增高的(d,e)，与人类体内记忆T细胞的aRME的增高是一致的。

总结和讨论

这篇文章的初衷是探索aRME在克隆细胞中的表达模式，结果发现clonal aRME这种模式在原代细胞和体内细胞中都非常低（<1%），而>95%的细胞内aRME是动态的，而且这种dynamic aRME的水平与细胞的转录活动、细胞的大小、免疫激活反应和细胞周期相关。

这篇文章的数据结果总的来说促进了对等位基因特异性基因表达的认识，并揭示了clonal aRME如何产生可变的表达和外显率，为细胞的异质性和个体的异质性提供了新的思路。但是我仍有几个疑惑，在细胞中低于<1%的具有clonal aRME模式的基因有什么作用，在物种间是否具有保守性，究竟是否会对表型产生影响，另外dynamic aRME的随机性和动态变化是否存在自身可以调节的一个平衡？