热力图（Heatmap）是统计学习中不可或缺的图形之一，在生信领域中尤为常见，它通过颜色的深浅程度来判断不同类别间的差异，通常结合数据特征的相关系数矩阵来判断其显著性。此外，还可以借助热力图呈现不同特征间的聚类关系，即利用不同特征的差异程度（利用相关系数矩阵、欧氏距离等度量方式），对其做聚类分析（如层次聚类，kmeans聚类等）。这里利用R语言中的相关R包，来介绍我的一些Heatmap绘图经验。
一、前期准备
1. 所用软件与版本：R 4.0.5
2. 所需R包：ggplot2 , Corrplot, pheatmap, dendextend, ggplotify, cowplot, ggpubr
3. 示例数据：随机生成的数据
二、教程
2.1 生成数据
set.seed(123)
dat = matrix(runif(5*5,0,1),nrow=5)
rownames(dat) = paste0("s",1:ncol(dat))
colnames(dat) = paste0("f",1:nrow(dat))
这里随机生成了25个0,1之间的均匀分布的随机数，其中，行是样本，列是特征，如图：
2.2 方案一 Corrplot
第一种方案绘制的Heatmap需要借助于Corrplot包，我们求出dat特征的相关系数矩阵，进一步利用corrplot函数来画图，在该包的官方文档中，对于corrplot函数的参数描述可以说是非常多，这里我给出几种常用的参数：
method 表示热力图中每一块所展示的形状，可选值有： "circle", "square", "ellipse", "number", "shade", "color", "pie"；
type 表示相关系数矩阵展示的方式，比如只展示上三角或下三角或者全部展示，可选值有：“full”，“upper"，"lower”；
tl.pos 指定文本标签(变量名称)的位置，当type=full时，默认标签位置在左边和顶部(lt)，当type=lower时，默认标签在左边和对角线(ld)，当type=upper时，默认标签在顶部和对角线，d表示对角线，n表示不添加文本标签；
diag 表示对角线上取值，默认为FALSE;
cl.pos 表示图例位置，当type=upper或full时，图例在右方，当type=lower时，图例在底部，不需要图例时，需指定该参数为n；
...
下面给出方法运用：
Cor = cor(dat,method = "pearson")
corrplot:: corrplot(corr = Cor, method = "color",type = "upper", tl.pos = "lt")
corrplot::corrplot(corr = Cor,add = TRUE, type = "lower", method = "number", diag = FALSE, tl.pos = "n", cl.pos="n")
当然，利用corrplot函数画图可以实现图层的叠加，上面这张图就是分上下两部分完成的，其中默认的颜色样式个人觉得还是可以的，只不过对于相关系数值会根据高低颜色深浅会发生变化，对于一些相关性低的值颜色会非常浅，所以看得不是很明显。
关于这个包具体的的使用方法可以参考这位博主写的文章：
(2条消息) R语言绘制热图（其实是相关系数图）实践(二）corrplot包_暴躁的搬砖工…-CSDN博客_corrplot
2.3 方案二 pheatmap
这里我们还是用方案一随机生成的矩阵，介绍用pheatmap包来绘制热力图。pheatmap包里关于绘制热力图的参数相对来说比较少，可以帮助我们快速的绘图，这里给出一些常用参数：
color 设置渐变的颜色，通常借助于colorRampPalette函数，比如说设置红黄蓝渐变，并在这之间分成50个等级，我们可以设置color=colorRampPalette(c("red","yellow","blue"))(50);
cluster_cols & cluster_rows 表示是否按行或列聚类，默认值为FALSE;
clustering_method 表示聚类方法，默认是complete,此外还"ward.D",“single”,“average”,等；
display_numbers 表示是否在heatmap里面显示数值，默认是FALSE；
show_rownames & show_colnames 表示是否显示行名或列名；
file 设置图片保存位置
...
下面给出方法运用
Cor = cor(dat,method = "pearson")
pheatmap::pheatmap(Cor, cluster_row = FALSE,cluster_col=FALSE )
去掉边框线可能会好看一点：
pheatmap::pheatmap(Cor, cluster_row = FALSE,cluster_col=FALSE ,border=FALSE)
由于是随机生成的数据，就不显示聚类的效果（只需要把cluster_row和cluster_col删掉即可），总体来说用pheatmap绘制热图会相对简单一点，但是毫不逊色于其他包绘制的热图。此外，如果想对于行或列来显示一些注释信息（annotation），比如将特征分成2类，每一类是不同的颜色，这里就可以先生成一个行名是特征，列名是分类结果的数据框，然后利用annotation_row(或col)参数，将生成的数据框赋给它即可，具体可以参考这位博主的文章：
2.4 方案三 ComplexHeatmap
接下来介绍的ComplexHeatmap包就比较全面了，他可以兼容pheatmap函数的所有功能，可以说是pheatmap包的加强版，能够创建更加复杂的热力图，如果你会pheatmap包的应用，那么在ComplexHeatmap包里面，你只需要指明是该包下的pheatmap函数即可使用（ComplexHeatmap::pheatmap()）。接下来列举出一些常用参数：
name 、column_title、row_title设置图例、列标题与行标题的名字；
column_title_side & row_title_side 设置列标题与行标题的位置，之注意：列标题只能跟"top"或"buttom"参数，行标题只能跟"left"或"right"参数；
column_names_side & row_names_side 设置行名与列名的位置，后面跟的是位置参数，如"left"、"top"等；
column_names_rot & row_names_rot 设置行名与列名的倾斜角度，后面跟的是角度，如0、30、90等；
column_names_gp & row_names_gp 设置行名与列名的颜色，比如 column_names_gp =gpar(col=rep("red",5));
column_title_gp & row_title_gp 设置列与行标题的颜色，注意：这个需要和聚类分割的数量来决定，要指定row_split & column_split，颜色的设置才能生效；
col 设置渐变的颜色向量参数，这里推荐用RColorBrewer包中的颜色，比如 col = rev(brewer.pal(n = 7, name ="RdYlBu"));
cluster_rows & cluster_columns 表示是否对行列进行聚类，默认是TRUE;
cluster_rows & cluster_columns 表示是否对行列进行聚类，默认是TRUE，如果是特定值，则表示对聚类树进行处理；
row_dend_reorder & column_dend_reorder 表示将行或列进行排序，默认是TRUE，所以我们在利用这个包绘制相关系数热力图时，会看到对角线不是1，那么我们就需要检查是否设置了这个参数；
show_column_dend & show_row_dend 表示是否展示行与列的聚类树；
...
下面利用上述随机生成的数据来绘制heatmap：
library(dendextend)
dend = hclust(dist(Cor))
dend = color_branches(dend, k = 2)
Heatmap(Cor,
name = "Color Key",
col = rev(brewer.pal(n = 7, name ="RdYlBu")),
cluster_rows = dend,
cluster_columns = F,
column_title = "This is a heatmap",
column_title_side = "top",
column_names_rot = 0 )
最值得一提的是，cluster_rows参数，可以结合hlust函数来使用，并通过color_branches函数来为不同类别设置颜色，使得整个heatmap看起来更加美观。如果我们要显示聚类后的数据分割并命名，我们可以这样：
dend = hclust(dist(Cor))
dend = color_branches(dend, k = 2)
Heatmap(Cor,
name = "Color Key",
col = rev(brewer.pal(n = 7, name ="RdYlBu")),
cluster_rows = dend,
cluster_columns = F,
column_title = "This is a heatmap",
column_title_side = "top",
column_names_rot = 0,
row_title = c("C1","C2"),
row_split = 2,
row_title_gp = gpar(col=c("red","blue"))
)
如若想得到更加详细的说明，可以看ComplexHeatmap包的官方文档，或者参见这位博主的文章：
使用ComplexHeatmap简单绘制热图 | KeepNotes blog (bioinfo-scrounger.com)
2.5 方案四 ggplot2
当然，画heatmap怎么能少的了ggplot2呢，我们在利用ggplot画图时，只需要设置scale_fill_gradient即可，例如：scale_fill_gradient(low = "yellow", high = "red") 表示颜色从黄色到红色渐变。注意要把数据处理成ggplot所需要的样式！下面来绘制heatmap:
Cor = cor(dat,method = "pearson")
datm=reshape2::melt(Cor)
## import my theme for ggplot
mytheme=theme_classic()+
theme(axis.text.x = element_text( hjust = 0.5, vjust = 0.5,
size=rel(1.25)),
axis.text.y = element_text( hjust = 0.5, vjust = 0.5,
size=rel(1.25)),
axis.title.x = element_blank(),
axis.title.y = element_blank(),
axis.ticks = element_blank(),
axis.line = element_blank(),
plot.title=element_text(size=rel(1.5),hjust = 0.5),
panel.grid.major = element_blank(),
panel.grid.minor = element_blank()
)
## draw heatmap
ggplot(datm, aes(x=Var2, y=Var1, fill=value))+geom_tile()+
ggtitle("Heatmap Example")+mytheme+
scale_fill_gradient(low = "yellow", high = "red")
如果要实现聚类树在heatmap上，我们需要利用ggtree函数，分别绘制聚类树与热力图，最后用aplot包进行拼接即可。
三、后记
3.1 Combine1
由于ComplexHeatmap包绘制的热力图是一个Heatmap对象，故他与其他图形不同，自身可以与其他Heatmap对象结合，我们只需要利用"+"号或者"%v%"连接符对多个Heatmap对象进行水平或垂直连接就可以了。
3.2 Combine2
当我们需要将pheatmap包绘制的热力图与ggplot画的其他图贴在一起时，我们可以利用ggplotify包来实现，具体操作流程为：
- p1 = pheatmap(...)
- p1 = as.ggplot(p1)
- plot_grid(p1,p2,p3) 注：plot_grid函数在cowplot包里面
我们用上回利用iris数据集画组合小提琴图的例子，进一步组合heatmap：
heatmap = pheatmap::pheatmap(Cor, cluster_row = FALSE,cluster_col=FALSE ,border=FALSE)
heatmap = as.ggplot(heatmap)
p$heatmap = heatmap
plot_grid(plotlist = p,align = "v",labels = LETTERS[1:5],nrow = 2)
当然ggplot也可以画heatmap，这里不再阐述，对于上面几种绘图方案，我们只需选取一种最美观，最有效的方式来画heatmap即可。
