✎ 文章导读
文章标题：Mass cytometry and transcriptomic profiling reveal body-wide pathology induced by Loxl1 deficiency
发表期刊/影响因子：Cell Prolif/2021-06/5.75
研究样本：外周血，17种小鼠组织
样本入组：Loxl 1(-/-)(KO）小鼠，野生型（WT）小鼠
文章亮点：1）利用RNA-Seq分析了Loxl1 KO和 WT 小鼠17种组织的转录特征，发现KO 小鼠中免疫应答和增殖过程相关的基因表达上调；2）基于CyTOF分析了Loxl1 缺失对全身性免疫响应变化；3）多个数据库联合分析Loxl1突变与癌症之间的临床相关性。
研究表明，赖氨酰氧化酶1（Loxl1）表达缺失会导致骨盆器官脱垂和剥脱综合征性青光眼，此外， Loxl1缺失还促进癌症等疾病发病机制。然而，其生物学功能效应与不同器官的临床相关性一直未得到深入研究。因此浙江大学邹晓晖课题组相关研究人员基于RNA测序和CyTOF技术联合评估了Loxl1（-/-）小鼠和野生小鼠的17种组织及外周血的生物功能表征，构建了小鼠全身器官的免疫特征。其中，CyTOF检测分析服务由普罗亭公司完成。
Loxl1 缺乏诱导的全身病理学特征
首先，研究人员发现Loxl1 缺失小鼠表现出弹性纤维异常相关的特征，包括盆腔脏器脱垂（POP），皮肤松弛等表征（Fig 1.A-B）。较之野生型小鼠，KO小鼠阴道和皮肤的弹性纤维呈现较薄的杆状特征，且KO小鼠模型中基底膜附近的弹性纤维降低（Fig 1.C-D）。此外，研究发现KO小鼠脾脏更长、体积更轻（Fig 1.E-F）。这些结果表明，Loxl1 缺陷对小鼠的影响不仅限于生殖道，且能够影响脾脏和其他器官。
Fig.1 Loxl1 缺失小鼠诱导的全身病理学特征
RNA-seq揭示Loxl1 缺陷小鼠多种组织中炎症和增生相关基因上调
随后，研究人员对小鼠模型的17种组织（心脏，肝，脾，肺，肾，皮肤，脑，主动脉，腹部脂肪，肠道，膀胱，直肠，阴道，骨骼肌，骨骼，软骨和尾部肌腱）进行了RNA-Seq以进一步评估Loxl1 缺陷导致的小鼠全身效应（Fig 2.A）。
研究发现，类似直肠和小肠、软骨和骨骼等相关性较大的组织可以基于基因表达聚类到一起，且KO与WT小鼠表达谱区分明显，表明测序结果的良好可重复性（Fig 2.B-C）。对于差异基因进行分析发现，脾脏中差异基因数量最多，表明Loxl1 缺乏对脾脏的影响程度最大。且差异基因变化具有不同的组织特异性，如脾脏中与细胞周期与分裂相关基因表达上调，与免疫应答相关基因表达下调（Fig 2.E-F）。
此外，研究人员对超过5种组织中变化明显的差异基因进行分析发现，上调基因主要与细胞外泌体、细胞基质、细胞核及基底膜等成分组成相关。此外，这些差异基因主要参与免疫系统变化、细菌响应和细胞增殖等过程，表明在转录组水平，多个组织参与了免疫和细胞增殖过程（Fig 2.G-H）。
Fig.2 RNA-Seq揭示Loxl1 缺陷小鼠组织中炎症和增生相关表达上调
KO小鼠组织增生与局部免疫细胞浸润
接下来，研究人员利用免疫荧光等进一步研究了KO小鼠中细胞增殖变化。研究发现较之野生型小鼠，KO小鼠的肠道上皮更厚，小肠绒毛更长，其他组织无显著变化（Fig 3.A）。此外，KO小鼠中阴道、小肠、直肠和肝脏中具有更高的Ki67表达(Fig 3.B-D)。除此之外，研究人员还研究了免疫细胞的局部渗透，发现KO小鼠中，阴道和小肠中CD45 +，CD19 +和F4 / 80 +细胞的数量增加（Fig 3. E-F）。这些结果表明Loxl1 缺乏诱导特定组织中的增生和局部免疫细胞浸润。
Fig.3 KO小鼠组织增生与局部免疫细胞浸润
基于CyTOF研究KO小鼠的全身免疫变化
基于前面转录组研究发现了免疫相关的基因上调，随后，研究人员又基于CyTOF设计了32个包含细胞表型、功能标记和细胞因子的细胞标记物，对WT和KO小鼠的外周血免疫细胞群体进行分析，以进一步评估Loxl1缺陷对全身免疫的影响（Fig 4.A）。进一步研究发现相比于野生型小鼠，KO小鼠中的CD4+T细胞和B细胞比例较低，CD8+T细胞、GD T细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和NK细胞的比例相对较高（Fig 4.B-D）。对其相关功能标志物的研究发现，CD4+T细胞显示出较高的ARG1，PD-1和CD44的表达，CD8 + T细胞表现较高的CD44和CD38的表达，NK细胞高表达CD38。同时，CD8+T细胞还低表达CTLA4，B细胞中CD62L，巨噬细胞中CD62L，CD44，MHCII，IL10和IL6以及中性粒细胞中CD44和IL6的表达较低（Fig 4.E）。这些结果表明在Loxl1 KO小鼠中T细胞和NK细胞激活，而B细胞，巨噬细胞和中性粒细胞在表现出较低水平的迁移和分泌。
Fig.4 基于CyTOF研究KO小鼠的全身免疫变化
LOXL1突变与癌症之间的临床相关性
前面研究人员分别从转录组和蛋白组研究了Loxl1 缺乏可以诱导免疫系统和组织过度增殖的变化，而这些是肿瘤的标志，因此研究人员进一步研究了LOXL1中的突变与癌症进展相关性。
通过对EXEA数据库、TGCA以及Canvar数据库中的数据进行挖掘分析，研究人员发现Loxl1 突变肿瘤患者中的比例显著高于正常人群(Fig 5.A-D)，且在泛癌患者中，Loxl1 突变肿瘤患者的整体存活率显著低于非突变肿瘤患者（Fig 5.E)。这些数据表明Loxl1 突变频率与肿瘤发生发展相关。对其GO分析发现，肝细胞癌患者中，Loxl1 突变患者中细胞周期、有丝分裂细胞周期、DNA损伤响应相关的GO项显著上调；肺腺癌患者中，与免疫相关，包括T细胞增殖，T细胞迁移，信号转导和细胞因子产生相关基因表达上调（Fig 5.F-G）。这些结果表明与非突变肿瘤患者相比，Loxl1突变肿瘤的患者不仅具有较低的存活率，而且还具有较低的生物过程，例如细胞增殖和免疫活化等基因的转录物。
Fig.5 Loxl1 突变与癌症之间的相关性
文章总结
在该研究中，研究人利用Loxl1 KO小鼠研究发现 Loxl1 缺陷诱导的弹性纤维活性异常可诱导一系列组织特异性的弹性蛋白相关修饰。 随后研究人员通过RNA-Seq联合CyTOF和组织学评估，证明小鼠的Loxl1 缺陷可促进多种组织中的局部免疫应答和增生，并且还诱导全身免疫功能的激烈变化。最后，通过数据库挖掘分析，研究人员证明了Loxl1 缺陷与肿瘤发生以及肿瘤患者存活率之间的相关性。该研究提供了一种强大的，筛选研究多器官中特定基因功能以及弹性蛋白在细胞及全身免疫中的生物学作用的策略，对理解ECM生物学和病理学至关重要。
【参考文献】
Li Y, et al. Mass cytometry and transcriptomic profiling reveal body-wide pathology induced by Loxl1 deficiency. Cell Prolif. 2021.
