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title:Single cell dynamics of tumor specificity vs bystander activity in CD8+ T cells define the diverse immune landscapes in colorectal cancer
author:
time:15 Nov 2023
journal: cell discovery (IF=33.5)
Objective:
通过激活ICBCD8+Tcell治疗MSI的CRC患者效果好，MSS的CRC患者治疗结果不稳定。那么CD8+ Tcell怎么导致的ICB治疗效果不同？
Results:
fig1a: 数据简介和分析流程，22个MSI 41个MSS样本，来自不同的数据库，所以作者强调了自己的去批次是独立MSS/MSI去做的
fig1b-c：MSI MSS分别的细胞分类，这里两边是不对应的
Fig1d: 细胞分群的占比
Fig1e-h:MSI (e) 和 MSS (f) CRC 的前 30 个高表达基因以及 MSI (g) 和 MSS (h) CRC 的前 13 个可变基因，按基因方差排序，突出显示相似基因的重叠水平升高MSI 和 MSS 数据集之间的高表达基因和可变基因。（这里的可变基因是怎么算的）
总体来说，MSI 和 MSS的CRC在细胞子类型上还是有大量重叠的。他这里的fig1 没有直接用传统的差异分析去看两组人群的差异，而是分别分析的。
因为IFN-y在其他文献中提及的作用，所以作者利用IFN-y把所有的cd8 Tcell分成了高表达和低表达：threshold of 0.2 log2-normalized CPM。
Fig2a: 比较了四组中IFN-y+ CD8 T cell 的占比，MSI 最高。
Fig2b: IFN-y的基因表达分布在MSI 和 MSS中间无差异。
Fig2c-d: 由于直接分析其他与IFN-y有关基因也没有很好的结果，所以作者又用了模块分析的方法，这里使用了层次聚类，具体怎么用基因定义新的细胞类型还需要仔细看方法。所以2c展示了MSI的IFN-y+ CD8 T cell 的聚类结果，MSS的结果在2d。总之，作者观察到 MSI CRC IFNG+CD8+ T 细胞具有肿瘤反应性耗竭和干细胞样祖细胞信号传导，而 MSS CRC IFNG+CD8+ T 细胞则表现出异质性炎症或耐受性特征。
Fig2e-f: 然后为了映射fig1中的分类，与fig2c-d中的分类做了比对图（需要细看方法）。在 MSI CRC 中（e），肿瘤反应性耗竭和记忆分化与TOX+CD8+ T memoryexhausted,、CD8+ T exhausted and CD8+ T residentmemory cells一致, 而the stem-like progenitor module 与CD8+ T central-memory and CD8+ T naive cells一致.MSS CRC的结果（d）会和MSI不同。但这里有个疑惑，作者认为MSS CRC 中的细胞主要偏向 EOMES 主导信号或 IL17AHIGH MAIT，以及混合的炎症/耐受性 CD8+ T 记忆耗尽细胞。难道是分类上有inflamed/tolerogenic CD8 T memory exhaused cell?如果这么说，fig1中也没有分出有关炎症的细胞类型，岂不是看fig1就知道MSS中存在这群特异的基因？
fig2g: 进一步讨论了MAIT细胞类型，将相关基因按照通路功能划分讨论MSI 和MSS之间的区别。
fig2h: 利用TCR测序结果，来自 MSS CRC 患者的 IL17A+ MAIT 的核黄素中间特异性 TCR 序列比对得分最高，但 MSI CRC 中的 IFNG+ MAIT 的情况并非如此。 MSS CRC 清楚地显示出对微生物来源的核黄素中间体特异的 IL17A+MAIT 的偏好。
总之，作者观察到 MSI CRC IFNG+CD8+ T 细胞具有肿瘤反应性耗竭和干细胞样祖细胞信号传导，而 MSS CRC IFNG+CD8+ T 细胞则表现出异质性炎症或耐受性特征。
Fig2i: 可视化了 IFNG+CD8+ T 细胞的 Spearman 相关密度分布，其中 x 轴为旁观者激活特征，y 轴为 TCR 激活特征，体现MSI 和MSS的区别：
MSI CRC IFNG+CD8+ T 细胞表现出更高的 TCR 激活，而 MSS CRC IFNG+CD8+ T 细胞则表现出异质性炎症和耐受性特征以及更高的旁观者样激活。（作者也用了通路富集来再次论证）
Fig3a： MSI/MSS CRC 中 IFNG+CD8+ T 细胞几乎占所有 TCR 克隆型扩展（定义为每个 TCR 克隆型的 CD8+ T 细胞数量），而不是 IFNG−CD8+ T 细胞，从而支持作者 IFNG+以 CD8+ T 细胞为中心的方法（为什么？）。 MSS CRC IFNG+CD8+ T 细胞比 MSI CRC IFNG+CD8+ T 细胞表现出更高的克隆型扩增。
Fig3b：然而，TCR 多克隆性或多样性（使用 Chao1 丰富度估计器计算 TCR 丰富度）在 MSI CRC IFNG+CD8+ T 细胞中相对较高，但不显著
Fig3c: 为了更好地确定这一点，作者根据预测抗原特异性的 TCR 家族对 TCR 克隆型扩展子进行了分类。大多数克隆型扩展子由预计可识别病毒抗原的 TCR 组成。
Fig3d: 考虑到 MSI CRC3 中的high neoantigen load，想知道这些 T 细胞是否具有新抗原反应性。在具有exclusive TCR 的 CD8+ T 细胞中，MSI CRC IFNG+CD8+ T 细胞表现出更高的 NeoTCR8 特征 （为什么只用比较exclusive的这个特征，是因为这个群是显著在MSI中高得吗），显著高于 MSS CRC 对应物。
Fig3e-f: 将 TCR 抗原/表位特异性预测与 IFNG+CD8+ T 细胞的亚群表型进行了比对。在MSI中，the exclusive TCRs were dominantly expressed by TOX+CD8+ T memory-exhausted cells(e)。viral TCR were primarily present in TOX+CD8+ T memory-exhausted cells in MSS(f).
取决于MSI or MSS, TOX+CD8+ T memory-exhausted cells 显示出 不同的 TCR specificities such as exclusive TCRs in MSI vs viral TCRs in MSS.
fig3g-h: 在MSI 和MSS中，使用每个 TCR 抗原特异性家族的 REACTOME 通路 进行了 IFNG+ 与 IFNG-CD8+ T 细胞的 GSEA 比较。MSI和MSS之间的富集通路不同。
fig4a-b：将来自 MSI CRC 和 MSS CRC 的 CD8+ T 细胞分为几个不同的组，这些组由5个和6个clusters, respectively using K Means。用的mca降维
fig4c-d：由于结果是依赖单细胞转录组数据的，因此作者认为有必要在蛋白质组水平上验证观察结果。在Cytof数据库的数据中，进行了轨迹分析，揭示了 MSI CRC CD8+ T 细胞的很大程度上独有的轨迹或 MSI 和 MSS CRC CD8+ T 细胞之间的重叠轨迹。（不知道用什么方法做的轨迹并且没有从图片中get到轨迹）
fig4e-h: 表面marker的差异富集分析显示MSI CRC CD8+ T cells 主要exposed markers of memory phenotype (CD12781), effector memory or polyclonal TCR phenotype (CD2582), immunoregulation (PDL183), T cell activation (CD5684), and cytokine signaling (CD12385)。MSS CRC CD8+ T cells主要标记contradictory inflammatory markers, i.e., immuno-regulation (PD-131), suppressor of T cell activity (CD3886), T cell activation (CD28, CD4487,88) and unconventional T cells (NKp4689)。
总之，观察到 MSI CRC CD8+ T 细胞暴露更多效应记忆样表面标记，而 MSS CRC CD8+ T 细胞显示异质或矛盾的炎症表面标记。
fig5a-b：肿瘤反应信号模块特别擅长捕获 MSI 与 MSS CRC 中对比的CD8+ T celldynamics，利用the tumor-reactive signaling modules对patients做了分类。然后把细胞亚型，TCR受体和一些免疫抑制受体信息与分类对应。总体而言，不同患者的 MSI 或 MSS CRC 的 CD8+ T 细胞特征存在很大差异。 MSI CRC 患者分为更同质的簇，具有相对一致的 CD8+ T 细胞动力学，而 MSS CRC 患者则表现出具有矛盾的 CD8+ T 细胞动力学的异质簇。（MSI不也分成了2群，为何觉得MSI的群更同质？？？）
fig6a-b: 肿瘤反应信号模块是否可以预测生存和immune subtype classification (ISC)呢？因此，作者研究了十个肿瘤反应性信号模块是否可以使用这些模块定义的 MSI 或 MSS 聚类对 374 名 TCGA MSI+（2类） 或 MSS（MSI-L 和 MSS，5类）CRC 患者进行分层
Fig6c-d: 不同分群患者的肿瘤反应信号模块的富集情况。CD8+ T 细胞的转录组衍生的肿瘤反应信号模块在新的 ISC 框架内对 CRC 患者的大量肿瘤转录组进行了熟练的分层。
fig6e-f：检查 ISC 簇的临床免疫学特征。（我理解的是：这里的临床免疫学特征是利用TCGA转录组和病理学数据做的，然后映射到作者的数据中），不同簇有很明显的不同的临床免疫学差异。
Fig6g: 在 MSI+ CRC 中，ISC1a 中 TCR 与旁观者激活特征的比率显着高于 ISC1b；
Fig6f: 在 MSS CRC 中，该比率在 ISC2a 中最高，此后呈梯度下降，直至达到 ISC3a/ 3b 中的最低点
Fig6i: 为了研究结肠组织特异性“自身”特征的作用，对联合批量校正的 TCGA-GTEx（基因型-组织表达）数据集进行了 ISC 预测，该数据集包含 GTEx 衍生的正常或非患病结肠组织的转录组和 TCGA 的 CRC 肿瘤转录组用于比较.(为啥不用自己的癌旁组织数据啊) 大多数正常组织被预测为 ISC2a 或 ISC2b，而所有其他类型在肿瘤组织中恢复得更加均匀。这表明在 MSS CRC 中，最具炎症性的簇（ISC2a、ISC2b）可能并不完全是肿瘤特异性的。因此，结果表明，“类自”旁观者信号在高度炎症性 ISC 类 MSS CRC 中可能非常普遍。
Fig6J-M：TCGA和SIDRA-LUMC CRC cohort的生存分析
Fig7a-b：评估了 ISC 簇是否能够显示出对免疫治疗反应的预测影响。基于这些 TCGA ISC 亚型构建了随机森林分类模型，以根据 MSI 或 MSSCRC 患者的批量转录组图谱预测 ISC 亚型标签。在接受抗 PD-1 ICB 治疗的 MSI CRC 患者中，持久缓解者被称为 ISC1a 的概率显着高于 PR/无缓解者，而对于后者的患者，模式完全相反.
Fig7c-e: 19 名 MSI CRC 患者 (GSE205506)104 的 scRNAseq 数据集中获取了肿瘤 CD8+ T 细胞的单细胞概况（图 7c），这些患者要么未经治疗，要么接受抗 PD-1 ICB 治疗，要么接受抗PD-1 ICB和塞来昔布的组合（图7d）。作者比较了持久反应者（CR）与其余反应者（非 CR）。CD8+ T 细胞中的干细胞样祖细胞和发炎的滤泡样信号模块可预测 MSI CRC 患者的持久免疫治疗反应。
Fig7f：结果总结
Summary：
对MSS和MSI的单细胞数据CD8 Tcell的深层分析，从四个转录组层面去分析不同人群，CD8+ T cell sub-populations, IFNG expression, predicted TCR antigen-specificities and tumorreactive signaling modules，最后利用机器学习分类预测人群和预后。对单细胞数据和TCR数据的深入讨论很值得学习，里面牵涉的算法和免疫学知识点很多，需要进一步深入学习。
Data:
single cell RNA
bulk seq
sc TCR-seq
surface proteome validation
data availability：
All major datasets (and associated meta-data and/or codes) analyzed for this project are either available on Synapse (Syn ID: syn41687327) or within the Supplementary Tables/Materials accompanying this manuscript.
code availability: yes，python code
Sth to learn:
summary what I learn from this paper
MSI和MSS本身之间的差异，MSS会有更多的炎症表型？
简单的差异分析不能直接回答问题，比如IFN-y 的差异较小，需要更复杂的分析来解释MSI 和MSS的预后差异
fig2c如何用聚类的基因进一步获得新的细胞类型的分类结果？是否可以理解为对IFN-y+ CD8 T cell 的再次细胞分型，这样做的话，和fig1的细胞类型定义有何不同？
利用sc TCR测序分析MAIT细胞类型
bystander-activation: 旁观者CD8+ T 细胞的激活及其在病毒感染中的作用。 在病毒感染期间，大量T 细胞以不依赖T 细胞受体和依赖细胞因子的方式被激活，这种现象称为“旁观者激活”
genetic signatures for TCR-activation and bystander-activation in T cells
为了在 TCR 谱系水平上“功能”验证上述转录组学观察结果，使用Scirpy来执行谱系映射以及对 CRC CD8+ T 细胞的 scTCR-seq 图谱进行抗原特异性预测。
Scirpy is a package to analyse T cell receptor (TCR) or B cell receptor (BCR) repertoires from single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) data in Python. It seamlessly integrates with scanpy and mudata and provides various modules for data import, analysis and visualization.
Immune Epitope Database (IEDB)
a multiple correspondence analysis (MCA)（MCA）
CyTOF dataset
a network topology-based analysis for network expansion (WEB-based Gene SeT AnaLysis Toolkit
a agglomerative clustering in the MSI or MSS manifold space defined by these modules
We performed normalized scoring across TCGA ISC clusters (Supplementary Table S6) for transcriptomic vs pathological image-based immune features: immune cell quantification from immune-deconvolution (quanTIseq), antigenicity parameters (Indel/SNV neoantigens, TCR/BCR Richness; TCGA data), and immune-landscape signatures (TCGA data) vs hematoxylin and eosin (H&E) tumor image-derived deep learning metrics describing behavior of tumor-infiltrating lymphocytes (TILs; TCGA data)
For tumoral microbiome analyses, we used the viral or bacterial call-outs predicted from nonhuman reads in TCGA CRC data via KRAKEN
record some words for writing
Of note
The above analyses emphasized the importance of at least four transcriptomic features across CRC CD8+ T cells, i.e., CD8+ T cell sub-populations, IFNG expression, predicted TCR antigen-specificities and tumorreactive signaling modules. However, the above analyses were supervised as reductionist approaches.
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