影响因子：11.4

研究概述：电压门控离子通道受跨膜电压电位变化的调节，参与神经元信号传输和上皮细胞分泌等多种生理过程。配体门控离子通道受神经突触和神经肌肉接头处神经递质等化学信使的调节。离子转运体通过能量消耗和构象变化积极地跨膜移动离子。缝隙连接建立了细胞间的连接，使离子和小分子能够在细胞间通过。我们将这些蛋白质统称为离子渗透组（IP）。离子渗透组在人类疾病中被广泛研究，其中包括许多药物靶点，尽管报道了一些离子通道在癌症通路中的作用，但迄今为止，还没有系统地探讨过 IP 基因在人类癌症中的转录组图谱和临床意义。胶质母细胞瘤是最常见、最致命的原发性脑癌，尽管结合了手术、放疗和使用 DNA 烷化剂替莫唑胺的化疗的多模式疗法，患者的中位生存期仅为 15 个月。单个 GBM 存在多种肿瘤和基质细胞群。这种巨大的肿瘤异质性导致了耐药性和肿瘤复发。因此，迫切需要确定可行的治疗靶点和治疗机会。本研究分析了 10,000 份人类癌症样本中 IP 基因的转录组图谱和临床关联，发现IP 基因在肿瘤亚组中的过度上调明显高于预期，揭示了肿瘤异质性的一个新方面。利用机器学习，作者建立了IP基因模型，这些基因的表达升高与患者的生存结果相关。在 GBM 中，作者重点研究了 GJB2 和 SCN9A 这两个 IP 基因，并利用患者来源的肿瘤细胞和异种移植模型证明了它们在促进 GBM 侵袭中的作用。这项研究强调了作为癌症标志的 IP 基因的改变，并为 IP 基因的功能性研究提供了有用的资源，以促进治疗和生物标记物的开发。研究概述如下：

泛癌生信分析，欢迎交流。

研究结果：

癌症中离子渗透组的转录组图谱

为了研究癌症中的IP，作者分析了TCGA中33种癌症类型的9352个患者的癌症转录组，研究了《药理学指南》数据库中的276个高置信度可药用IP基因。作者首先使用降维方法研究了IP基因的泛癌症表达，发现癌症样本根据组织和器官系统进行了聚类（图A）。例如，GBM 和低LGG聚类在一起，肾癌亚型也是如此。器官特异性集群也很明显，如与消化道相关的COAD、直肠癌、胰腺癌和胃腺癌。一些癌症类型也呈现出明显的集群，如SKCM和UVM。接下来，作者筛选了在特定癌症类型的大多数样本中表达的 IP 基因。与同一癌症类型的其他样本相比，一个典型的 IP 基因在一小部分样本（9%）中上调了 10 倍（图 B）。根据Tukey's outlier analysis，每个癌症样本平均有 49 个（18%）IP 基因受到影响（图 C）。在大多数癌症类型和泛癌症队列中都发现了 IP 基因的广泛过表达。接下来，作者研究了具有开关样活化的 IP 基因子集，其定义是在大多数癌症样本中表达为零，而在特定癌症类型的不到一半样本中表达不为零的基因。开关样激活平均影响了另外 18% 的 IP 基因（图 D、E）。一个典型的 IP 基因在高表达组癌症样本中的表达量为数百个拷贝，而一些基因的表达量超过了这些水平的几个数量级（图 F）。

多种癌症类型中离子渗透组基因的生存关系

为了研究 IP 基因在癌症病理学中的重要性， 作者使用了一种机器学习方法，系统性地优先选择了个别癌症类型中与患者生存显著相关的 IP 基因。具体来说，作者在以 IP 基因表达谱为特征的癌症样本子集上训练了一组Cox风险比例模型，然后进行了正则化处理，在每个模型中选出了信息量最大的 IP 基因，将模型中反复选择的 IP 基因鉴定为候选基因。作者在 33 种癌症类型中发现了 206 个 IP 基因，其中 410 个基因与患者的生存期有关（图 A,B），平均在每种癌症类型中发现了 12 个 IP 基因，而大多数与预后相关的 IP 基因只在一种或两种癌症类型中发现（74%），这与癌症中 IP 表达的组织特异性聚类一致（图 A）。在多种癌症类型中都发现了几个排名靠前的 IP 基因，其中 ACCN2、GRIN2D 和 TRPV3 在六种癌症类型中与预后不良有关，P2RX6 在七种癌症类型中与预后不良有关，P2RX6 编码一种 P2X 受体，可增加肾癌细胞的迁移和侵袭，ACCN2 被证明能促进乳腺癌的肿瘤生长和转移，GRIN2D 是结直肠癌的血管生成肿瘤标志物，TRPV3 编码一种瞬态受体电位阳离子选择性通道，参与温度调节途径。

GJB2或SCN9A的高表达与GBM患者的不良生存率有关

作者重点研究了 GBM 中的 IP 基因，因为其靶点识别需求尚未得到满足。作者发现了四个高置信度 IP 基因，它们都在高危患者中高度表达：GJB2 与非综合征性听力障碍有关，SCN9A 与周围神经系统的痛觉有关，AQP9 与肾癌有关，KCNN4 与 GBM 有关。鉴于 KCNN4 在 GBM 中的功能，作者将其作为阳性对照进行分析，随后作者在考虑了患者年龄和性别的多变量分析中证实了这些基因的预后价值（图 A）。GJB2 和 SCN9A 的表达也与低级别胶质瘤、肾癌和子宫癌的不良预后有关，这进一步增强了这些基因的可信度。基于以上结果，作者选择 GJB2 和 SCN9A 作为 GBM 的进一步研究对象。就 GJB2 而言，高离群表达的 GBM 患者预后最差，而就 SCN9A 而言，基因表达高于中位数的 GBM 患者预后较差（图 B）。随后，作者分析了Ivy GBM 图谱的解剖转录数据集（图C）,微血管增生区域显示 GJB2 和 SCN9A 表达减少，这代表了由常驻内皮细胞和分化的恶性细胞组成的 GBM 标志，基质部分的 GJB2 和 SCN9A 表达较低，主要包括非恶性成纤维细胞。GJB2 的较高表达出现在 GBM 的坏死中心附近的假性化脓区和坏死周围区。

接下来，作者研究了GBM转录组学和甲基化亚型中的GJB2和SCN9A（图C），预后较差的间质 GBM 和相关甲基化亚型 class-1 中 GJB2 表达较高。根据这两种分类发现，经典 GBM 中 SCN9A 的表达较低。随后，作者利用GBM的单细胞转录组学数据集确定了表达GJB2和SCN9A的细胞类型（图D），这两个基因都在肿瘤细胞亚群中表达，而在非癌细胞中则检测不到它们的表达。在肿瘤细胞中，GJB2 在分化的 GBM 细胞中表达较高，而在增殖的干样细胞中表达较低。与 GJB2 相比，SCN9A 在各肿瘤细胞类型中的表达更为一致。除此之外，GJB2 在骨髓细胞中表达，而 SCN9A 则在巨噬细胞中表达。其他非癌细胞中这两个基因的表达很少或没有表达。随后基于GTEx的差异分析表明GBM 的 GJB2 和 SCN9A 表达量明显高于正常脑样本。

GBJ2 或 SCN9A 基因敲除会降低增殖和神经元投射通路的功能

接下来，作者使用shRNA沉默了GBM细胞系G729的GJB2和SCN9A并进行了二代测序，分别有4647个和2088个差异基因（图A，E），随后作者使用ActivePathways方法进行了通路富集，发现了四类关键通路：细胞增殖、神经和大脑发育、信号转导以及细胞骨架和细胞外基质过程，具体细分有 350 个重要过程和通路（图 B），这些通路包括细胞增殖、细胞周期失调、DNA 复制和神经凋亡等癌症标志，以及 Wnt 通路等信号转导级联。癌症增殖和侵袭基因被下调，包括在胶质瘤中具有预后价值的增殖标记基因 MKI67、参与 GBM 侵袭的神经生长因子受体 NGFR以及在 GBM 中具有肿瘤抑制功能的长非编码 RNA MALAT1（图E）。在整合通路分析中，作者重点研究了一组与这两个基因相关的神经元突起过程，包括更广泛的过程，如神经元投射发育的调控，轴突生成和树突发育等（图 C）。为了对这些通路中的单个基因进行优先排序，作者进行了互补网络分析，利用 BioGRID 数据库中的相互作用组重建了一个PPI网络，该网络捕获了 102 个差异表达的神经元突起基因（图 D）。该网络突出显示了参与 GBM 的致癌 PI3K/AKT 信号通路中的 AKT1 和 PIK3R1，以及肿瘤抑制因子 patched 同源物 1（PTCH1）。PTCH1 在 GJB2 和 SCN9A 基因敲除中上调，而 AKT1 和 PIK3R1 在 SCN9A 基因敲除中下调（图 E）。

GJB2 促进TNTs的形成，调节丝状体动力学，并增加 GBM 的侵袭能力

为了明确 GJB2 在 TNTs 中的作用，作者使用三种源自患者的间充质 GBM 细胞系研究了 GJB2 敲除后的细胞表型：G411、G729 和 G797。首先，作者确定了 GJB2 敲除对 Rho GTPase 通路基因的影响，GJB2 敲除明显降低了 RAC Rho GTPase 基因 RAC1、RAC2 和 RAC3 的表达，这与之前的通路富集结果一致（图 A）。同样，在 GJB2 敲除的细胞中，TNT 相关信号适配基因 CDC42SE2 下调，而肿瘤抑制因子 PTCH1 则显著上调。此外，GJB2敲除还降低了 RAC1 蛋白的表达（图 B）。接下来，作者监测了源自患者的 GBM 细胞系的 TNT 动态（图 C），发现在敲除 GJB2 后，所有 GBM 细胞系的 TNT 长度都显著减少。接下来，对表达膜GFP（mGFP）的G411细胞进行延时成像发现，GJB2敲除降低了丝状体的最大延伸长度和寿命，而丝状体的延伸率和总数保持不变（图D）。综上所述，这些结果表明 GJB2 可调控 GBM 细胞中的丝状体动力学和 TNT 的形成。

为了描述 GJB2 在体内 GBM 中的作用，研究人员使用了用针对 GJB2 的 shRNA 或非针对 GJB2 的对照组处理的 mGFP G411 异种移植物的时间匹配肿瘤。免疫荧光显示，GJB2 的敲除显著降低了肿瘤中 RAC1 和 pMLC2 的水平（图 E），这些结果证实了先前的计算和体外实验结果，即 GJB2 是 RAC 信号转导的关键调节因子。在 GJB2 基因敲除的肿瘤中，侵袭性肿瘤集落的大小显著降低（图 F）。与对照组肿瘤相比，GJB2敲除肿瘤的丝状体长度缩短（图 G）。这些结果表明，GJB2 促进肿瘤侵袭并调节体内 GBM 细胞的丝状体。

GJB2 和 SCN9A 促进体内外 GBM 的生长

最后，作者选取了GJB2和SCN9A表达较高的G411、G729、G797三种患者间质GBM细胞系以研究GJB2 和 SCN9A 在调控 GBM 细胞体外生长和体内致瘤潜能方面的作用。首先，作者发现 GJB2 或 SCN9A 的敲除大大降低了 GBM 细胞的活力（图 A），随后使用LDA和pHis3两种方法评估了细胞的整体增殖能力，发现敲除 GJB2 或 SCN9A 能有效阻止球形成（图 B、C），并显著降低有丝分裂细胞的百分比（图 D）。接下来，作者研究了 GJB2 和 SCN9A 在调节体内 GBM 生长中的作用，将表达荧光素酶的 G411 细胞正位注射到免疫缺陷的 NOD-SCID γ 小鼠体内，发现GJB2或SCN9A基因敲除明显减少了肿瘤的生长（图E），且小鼠生存期明显延长（图F）。这些结果确立了 GJB2 和 SCN9A 作为 GBM 侵袭的功能性调控因子的地位。

研究总结：

本研究使用机器学习方法在 33 种癌症类型中鉴定了 410 个与生存相关的 IP 基因，并发现GJB2和SCN9A在肿瘤细胞中表现突出，与胶质母细胞瘤的不良预后有关。在源自患者的胶质母细胞瘤细胞中敲除 GJB2 或 SCN9A 会诱导涉及神经元投射和增殖途径的全转录组变化，损害体外肿瘤细胞活力，扰乱隧道纳米管动力学，并延长胶质母细胞瘤小鼠的存活期。因此，异常激活编码离子转运蛋白的基因似乎是定义肿瘤异质性的一种泛癌症特征，可用于新靶点和新疗法的开发。