01 什么是原位杂交技术？
20世纪中期DNA双螺旋结构解开了尘封亿万年的神秘面纱，半保留复制、中心法则、遗传密码相继问世，这些已成为现今生命科学研究的基础。而此阶段大多以离体研究的方式来逐步推理生命过程发生机制，这限制了人们对真相的直观认识，围绕中心法则人们尝试以“真像（原位图像）”还原真相的方式来证实，便开启了一种生物大分子原位可视化的方法ISH（in situ hybridization）原位杂交技术的发展。FISH技术历经近半个世纪，在各类基础科学及临床应用中依旧发挥着不可替代的作用。
原位杂交技术是一种应用碱基序列互补原则，针对特定靶标序列设计带标记的探针进行分子杂交的原位检测方法，用以展示DNA或RNA以及蛋白质等生物大分子在细胞和组织中的空间定位定量信息。大多研究方法以组织或细胞或单分子为单位，将各组分从研究对象中提取出来进行单因素研究。但个体功能机制的形成往往涉及多细胞（不同类型不同状态的细胞）、多层面（基因、转录物、蛋白、代谢物、表观修饰、环境等）等多因素影响，最终需要将各组分还原到原位，以高保真的方式呈现细胞瞬态分子事件。
02 原位杂交技术的发展
part 01
早在1941年Coons等人则尝试了用抗体荧光衍生物来示踪抗原 [1]。1969年放射性原位杂交技术首次被用于爪蟾卵母细胞的rRNA [2]和DNA [3]可视化(图1)。1975年珠蛋白的转录本被可视化 [4]。然而放射性元素的标记探针限制了FISH技术的广泛应用。此后荧光标记、化学标记或生物素标记的ISH相继在1977年、1982年和1985年被开发出来，提高了空间分辨率及检测通量，缩短了显色所需曝光时间，并进行了三维组织印染，使原位杂交技术得到更广泛的应用 [5-7]。1989年果蝇的整体组织原位杂交技术（WM ISH）被实现 [8]，到1993年WM ISH技术在多个物种被应用 [9]。
（A）卵原细胞核中央核仁上显示银色颗粒(箭头)。
（B）两个细线期细胞核边缘区有银色颗粒(箭头)。
（C）3个未标记的卵泡核和3个标记的粗线期细胞核。粗线期细胞随着细胞核增大染色体外rDNA逐渐增加。
part 02
传统原位杂交应用信号放大标记的探针与互补的靶分子进行杂交，通过地高辛、碱性磷酸酶、生物素、荧光等标记对已杂交的靶分子进行原位显色。但传统原位杂交的方法无法同时展示多种mRNA的表达模式；直接标记标荧光基团的探针成像信噪比低；运用酶促反应使底物富集在杂交的靶序列探针周围，信号漂移，单细胞空间分辨率低；多靶标的整体组织杂交耗时近5天。因此传统原位杂交技术存在检测通量低、分辨率低、无法对靶标分子数进行定量、耗时长等缺陷。
为弥补这些不足，麻省理工的Sanjay Tyagi团队开发了一种单分子FISH杂交技术(图2)，实现对特定基因进行空间定位定量检测。优化了传统荧光杂交中荧光标记成本高、纯化效率低、荧光基团过密集后自淬灭及杂交效率低等问题，将传统原位显色功能提升到了空间定量分析的范畴，但由于单分子FISH的荧光信号介于光学衍射极限内，信号识别依赖于超分辨显微镜，因此单分子FISH方法的普适性较低 [10]。
（A）探针杂交的结构示意图。用于检测GFP编码序列的48个探针用Alexa 594标记，用于检测3′UTR中串联重复的四个不同探针用TMR标记；
（B）在CHO细胞中的Z轴荧光图像的最大投影图，Alexa 594通道（左）和TMR通道（右）中分别对应于GFP编码区域探针和UTR探针；
（C）b中方框所示区信号的伪色合并图，圆圈代表识别的mRNA信号；标尺5 μm。
part 03
为进一步提升荧光信号强度，各类荧光信号放大方法不断被开发。加州理工学院的Harry M. T. Choi研究团队应用杂交链式反应开发出一种多重、等温、杂交连锁反应扩增信号的技术HCR（Hybridization Chain Reaction）(图3) [11-13]。借用标准荧光成像设备在整个斑马鱼胚胎中实现了4个目标mRNA的同步原位杂交。RNAscope公司及苏黎世大学的Thomas Stoeger和Lucas Pelkmans团队应用体外生成的分支DNA长链逐级杂交的方式，形成分支杂交荧光簇，实现了宽场荧光显微镜下对单分子的检测，均产生了极高的信噪比、检测效率及数据相关性 [14, 15]。但体外DNA长链生成及纯化过程复杂且成本高，哈佛大学的Peng Yin团队进一步优化了长链DNA生成方式，应用序列特异的检测探针实现了7个转录本的原位杂交与2种蛋白的免疫荧光共同检测，并使用荧光组合色及序列荧光杂交解读了染色体17个位点的空间构筑 [16]。
更多新型的FISH技术也在不断被开发，旨在于获得一种检测效率高、信噪比高、特异性强、操作便捷、成本可控、自动化程度高的原位检测方法。
（A）HCR机制；（B）原位杂交方案；（C）实验时间表。
原位杂交技术历经半世纪的技术革新洗礼，不断迭代更新，正在演化出一种兼顾高通量测序所获得的单细胞多组学大数据与单细胞单分子空间分辨率的新技术-空间组学技术。空间组学技术可以无限倍率放大至亚细胞（光学分辨率）或缩小至整个机体或群体，带你探寻生老病死的始末由衷，鸟瞰宏伟绚丽的生命分子构筑。原位杂交技术还在不断发展与优化，以承载科技革新需求，顺应时代发展潮流，还原本体真实构像。
参考文献：
1. Coons, A.H., Creech, H.J. & Jones, R.N. Immunological Properties of an Antibody Containing a Fluorescent Group. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine 47, 200-202 (1941).
2. Gall, J.G. & Pardue, M.L. FORMATION AND DETECTION OF RNA-DNA HYBRID MOLECULES IN CYTOLOGICAL PREPARATIONS. Proceedings of the National Academy of Sciences 63, 378 (1969).
3. John, H.A., Birnstiel, M.L. & Jones, K.W. RNA-DNA Hybrids at the Cytological Level. Nature 223, 582-587 (1969).
4. Harrison, P.R., Conkie, D., Paul, J. & Jones, K. Localisation of cellular globin messenger RNA by in situ hybridisation to complementary DNA. FEBS Letters 32, 109-112 (1973).
5. Langer-Safer, P.R., Levine, M. & Ward, D.C. Immunological method for mapping genes on Drosophila polytene chromosomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 79, 4381-4385 (1982).
6. Rudkin, G.T. & Stollar, B.D. High resolution detection of DNA-RNA hybrids in situ by indirect immunofluorescence. Nature 265, 472-473 (1977).
7. Newman, G.R., Jasani, B. & Williams, E.D. Sensitive system for visualising biotinylated DNA probes hybridised in situ. J Clin Pathol 39, 230 (1986).
8. Tautz, D. & Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma 98, 81-85 (1989).
9. Rosen, B. & Beddington, R.S. Whole-mount in situ hybridization in the mouse embryo: gene expression in three dimensions. Trends Genet 9, 162-167 (1993).
10. Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S.A., van Oudenaarden, A. & Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat Methods 5, 877-879 (2008).
11. Choi, H.M.T., Beck, V.A. & Pierce, N.A. Next-generation in situ hybridization chain reaction: higher gain, lower cost, greater durability. ACS Nano 8, 4284-4294 (2014).
12. Choi, H.M.T., et al. Third-generation in situ hybridization chain reaction: multiplexed, quantitative, sensitive, versatile, robust. Development 145 (2018).
13. Dirks, R.M. & Pierce, N.A. Triggered amplification by hybridization chain reaction. Proc Natl Acad Sci U S A 101, 15275-15278 (2004).
14. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J Mol Diagn 14, 22-29 (2012).
15. Battich, N., Stoeger, T. & Pelkmans, L. Image-based transcriptomics in thousands of single human cells at single-molecule resolution. Nat Methods 10, 1127-1133 (2013).
16. Kishi, J.Y., et al. SABER amplifies FISH: enhanced multiplexed imaging of RNA and DNA in cells and tissues. Nat Methods 16, 533-544 (2019).
