扩增子测序不同于其他高通量测序项目，扩增子测序往往样品量较大，但单个样品的数据量要求不高（因为仅仅研究扩增区域的序列）。为了节约成本，研究者们通常会把多个样品混在一个文库，并给不同样品加上一段 Barcode 序列。在后续的生物信息分析中，根据 Barcode 序列即可将不同样品的序列拆分开来。接下来介绍两个序列拆分工具
seqtk_demultiplex 和 fastq-multx。
seqtk_demultiplex
seqtk_demultiplex 安装
wget https://github.com/jameslz/fastx-utils/raw/master/seqtk_demultiplex
# seqtk_demultiplex 要求GLIBC_2.14版本
wget http://ftp.gnu.org/gnu/glibc/glibc-2.14.tar.gz
mv glibc-2.14.tar.gz /opt/sysoft
cd /opt/sysoft
tar zxvf glibc-2.14.tar.gz
cd glibc-2.14
mkdir build
cd build
../configure --prefix=/sysoft/glibc-2.14
make -j4
make install
cp /opt/sysoftglibc-2.14/lib/libc-2.14.so /lib64/
cd /lib64
mv libc.so.6 libc.so.6.back
# 报错不用管 error while loading shared libraries: libc.so.6: cannot open shared object file: No such file or directory
/sbin/sln libc-2.14.so /lib64/libc.so.6
#查看支持版本
strings /lib64/libc.so.6 |grep GLIBC
# en_US.UTF-8报错
echo "LANG=en_US.utf-8\nLC_ALL=en_US.utf-8" > /etc/environment
source /etc/environment
localedef -v -c -i en_US -f UTF-8 en_US.UTF-8
seqtk_demultiplex 参数
-1, 测序正向fastq序列，fastq文件，支持gz压缩文件
-2, 测序反向fastq序列，支持gz压缩文件
-b, barcode的文件
-d, 输入文件目录；
-l, barcode 序列长度（如长度大小不一致，填写最短的序列长度），默认5；
barcode 文件格式 (制表符分隔：共三列，第一列为样本名，第二列为正向barcode，第三列为反向barcode)
itaq1 ATCACG TCTAAT
itaq2 CGATGT TCTAAT
itaq3 TTAGGC TCTAAT
itaq4 TGACCA TCTAAT
itaq5 ACAGTG TCTAAT
itaq6 GCCAAT TCTAAT
itaq7 CAGATC TCTAAT
seqtk_demultiplex 使用
./seqtk_demultiplex -b barcode.txt -1 itaq.1.fastq -2 itaq.2.fastq -l 6 -d seqtk_output
# 因为桥式PCR测序过程中双端序列方向不一定一致，因此需要颠倒两测序文件进行二次拆分，具体参见fastq_multx操作
fastq-multx
seqtk_demultiplex 在拆分数据时无法设置 barcode 允许的错配碱基数，fastq-multx 中可以设置其参数。
fastq-multx 安装
git clone https://github.com/brwnj/fastq-multx
cd fastq-multx
make
fastq-multx 参数
-o, 输出文件，一个输入文件一个输出文件流，格式： %.R1.fq.gz， %为barcode对应的样本名
-m, barcod允许的主要错配个数，一般设置为0， 默认1
-B, barcode文件，允许单端和双端barcode
-n, 打印barcode序列
-b, 从序列的5'端碱基开始匹配barcode
-e, 从序列3'端开始匹配序列
-q, 控制barcode碱基的最小phred quality值，默认为0，不控制
-d, 控制匹配的最佳barcode位置和此佳barcode位置的位置，两个匹配距离不能超过2个碱基
barcode 文件格式 (制表符分隔：单端 barcode 只需要提供两列数据，双端 barcode 需要中间加上 ‘-”)
itaq1 ATCACG-TCTAAT
itaq2 CGATGT-TCTAAT
itaq3 TTAGGC-TCTAAT
itaq4 TGACCA-TCTAAT
itaq5 ACAGTG-TCTAAT
itaq6 GCCAAT-TCTAAT
itaq7 CAGATC-TCTAAT
fastq-multx 使用
mkdir fastq_multx_output-1
./fastq-multx/fastq-multx -B barcode.txt -m 1 -b itaq.1.fastq itaq.2.fastq -o %.R1.fastq -o %.R2.fastq
# 因为桥式PCR测序过程中双端序列方向不一定一致，因此需要颠倒两测序文件进行二次拆分
mkdir fastq_multx_output-2
./fastq-multx/fastq-multx -B barcode.txt -m 1 -b itaq.2.fastq itaq.1.fastq -o %.R1.fastq -o %.R2.fastq
# 合并两次拆分的结果
mkdir fastq_multx_output
for i in `ls fastq_multx_output-1/itaq*.R1.fastq`; do a=${i/.R1.fastq/}; a=${a/fastq_multx_output-1\//}; echo "$a"; done > sample.list
for i in `cat sample.list`; do echo "cat fastq_multx_output-1/$i.R1.fastq fastq_multx_output-2/$i.R2.fastq > ./fastq_multx_output/$i.R1.fastq"; done > command.combine.R1.list
for i in `cat sample.list`; do echo "cat fastq_multx_output-1/$i.R2.fastq fastq_multx_output-2/$i.R1.fastq > ./fastq_multx_output/$i.R2.fastq"; done > command.combine.R2.list
sh command.combine.R1.list
sh command.combine.R2.list
fastq-multx 操作方便，但是反向序列的barcode没有被切除，需要后续进一步处理。
参考：
