title: 综述-The gasdermins, a protein family executing cell death and inflammation
date: 2019-11-16 12:00:00
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前言

这篇文献是邵峰于2019年11月发表在《Nature Reviews Immunology》上的综述，对gasdermin的最近研究做了总结，对天然免疫有兴趣的同学可以读一读。

注：由于gasdermin没有相应的中文译名，我个人觉得可以译为“焦孔素”比较好。

文献信息

Broz, P., et al. (2019). "The gasdermins, a protein family executing cell death and inflammation." Nature Reviews Immunology.

文献摘要

gasdermins是最近鉴定出来的一个具有成孔效应蛋白家族，这个家族的能造成膜通透性(permeabilization)与细胞焦亡(pyroptosis)，细胞焦亡是一种裂解性的，炎症性的细胞死亡形式。gasdermins含有一个细胞毒性的N末端结构域和一个C末端的抑制结构域，它们通过一 个柔性构件连接。这两个结构域之间的连接蛋白水解后，就会解除细胞毒性结构域的分子内抑制作用，使N末端结构域插入到细胞膜中，形成大寡聚孔，从而破坏细胞的离子稳态并诱导细胞死亡。gasdermins诱导的细胞焦亡在许多遗传病、自身炎症性疾病和癌症中扮演着重要的角色。篇综述讨论了gasdermin最新的研究进展，重点涉及gasdermin活化、孔形成和gasdermin诱导的膜通透化。

相关术语

1. inflammasome（炎症小体）：一种多蛋白信号转导复合物，当检测到宿主来源或病原体来源的危险信号时，炎症小体就会在细胞质开始组装，促进细胞因子的释放，细胞的焦亡型死亡以及炎症。
2. caspases（半胱天冬氨酸蛋白酶）：半胱氨酸依赖性天冬氨酸蛋白酶家族，它作用于底物上特定的天冬氨酸残基，这个家族的酶在细胞死亡和炎症中发挥着核心功能。
3. necrosis（坏死）：细胞死亡方式之一，细胞经历这种死亡形式时，细胞膜丧失完整性，释放细胞成分。
4. NLRP3：英文全称是Nucleotide- binding oligomerization domain, leucine- rich repeat and pyrin domain- containing 3，即核苷酸结合寡聚结构域，富含亮氨酸重复序列和含Pyrin结构域3，这是组装炎症小体的细胞质感受器。NLRP3是一个广谱感受器，它能识别病原体相关和损伤相关分子模式。
5. Pannexin-1 channels（膜联蛋白-1通道）：一种细胞膜通道，可以通透离子和小分子代谢物，例如ATP。
6. NETosis：中性粒细胞的一种特殊死亡方式，其特征是释放DNA，组蛋白和颗粒内容物到细胞外空间。
7. Liposomes（脂质体）：由磷脂组成的，含有至少一个脂质双层的人造球形囊泡。
8. Mitophagy（线粒体自噬）：在营养饥饿或线粒体应激的情况下，通过自噬选择性地去除线粒体。
9. ASC foci（ASC焦点），英文全称为apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain foci，即含有caspase募集结构域焦点的凋亡相关斑点样蛋白，这是一个多聚体蛋白，由炎症小体蛋白的同源寡聚引发的螺旋原纤维形成。
10. Familial Mediterranean fever（家族性地中海热）：一种常染色体隐性遗传性自身炎症疾病，由MEFV基因突变引起，该蛋白编码蛋白Pyrin，疾病的特征是自限性发热和浆膜炎(Serositis)。
11. Pyrin：由细菌诱导的RHO修饰和肌动蛋白细胞骨架动力学破坏的炎症小体形成的细胞质感受器。由MEFV基因编码。
12. Peroxisomes（过氧化物酶体）：真核细胞的过氧化物酶体细胞器参与不同脂肪酸的分解代谢和活性氧的减少。
13. NLRP1：英文全称为(Nucleotide- binding oligomerization domain, leucine- rich repeat and pyrin domain- containing 1，即核苷酸结合寡聚结构域，富含亮氨酸重复序列和含1个Pyrin结构域，这是一个细胞质感受器，组装成炎症小体。它通过N末端规蛋白酶体降解途径(N-end rule proteosomal degradation pathway)活化。
14. NLRC4：英文全称为Nucleotide-binding oligomerization domain, leucine-rich repeat and caspase recruitment domain-containing 4，即核苷酸结合寡聚结构域，富含亮氨酸重复序列和含caspase募集结构域-4，一种炎症小体支架蛋白(scaffold protein)，与炎症小体感受器(NLR家族凋亡抑制蛋白(NAIP))结合时寡聚化，并形成活化caspase 1的平台。
15. Toll样受体：位于内体和细胞膜上的一类模式识别受体，识别病原体相关和损伤相关的分子模式，并启动信号通路以诱导炎症。

前言

gasdermin基因家族最早于20世纪初报道，该家族的基因当时是作为小鼠皮肤突变的候选基因来进行研究的。gasdermin这个名称是基于gasdermin A(GSDMA) 蛋白只表达在小鼠的肠道(gastrointestinal tract )和皮肤上皮细胞(epithelium of the skin)中。早期的研究还发现，gasdermin与DFNA5（deafness autosomal dominant non-syndromic sensorineural 5）的N末端区域的序列非常相似，DFNA5这个蛋白于1998年发现，它与人类的非综合征型常染色体显性遗传性有关。基于这种同源特性，一些其它的gasdermin家族的成员以及gasdermin样蛋白也被陆续鉴定出来了，目前在人类中有6个同源基因( paralogous genes)，即GSDMA，GSDMB，GSDMA，GSDMD，GSDME（也被称为DFNA5）和PJVK（也被称为DFNB59）（Fig.1a)。

gasdermin家成员是基于序列同源进行鉴定的，它们表示出不同的组织表达特征（Box 1与Table 1）。但是在过去的15年里，这些蛋白的精确功能却并不清楚。尽管如此，在这些蛋白被鉴定后不久，人们就发现了这些蛋白与细胞活力和炎症之间存在着某些联系。例如在小鼠方面，Gsdama3（编码小鼠的GSDMA3蛋白）的9种突变体与小鼠的脱毛有关，并伴随着明显的干细胞耗竭，角化过度(hyperkeratosis)以及炎症。另一方面，敲除Gsdma3基因后，小鼠并不表现出肉眼可见的皮肤表型，这说明，Gsdma3基因的突变体增加了某些功能。表明gasdermins潜在细胞毒性的最直接证据的研究指出，使用某些突变的，C末端截短式的人源GSDME能够导致酵母细胞的细胞周期停滞，以及人类细胞（凋亡型）的死亡。不过，gasdermins是否是细胞死亡程序体(cell death programme)的组成部分，以及这些蛋白控制的细胞死亡类型仍然不清楚。

2015年，两项独立的研究揭示了gasdermin功能的机制，随后不久，第三项研究证实了gasdermin的作用机制。这些研究表明，GSDMD是焦亡的唯一执行者(BOX 2)。自从这一发现以来，大量的文献开始描述gasdermins在炎症生物学、细胞死亡等方面的作用。在这篇综述中，我们讨论了对gasdermin激活和调节、gasdermin孔隙的组装和gasdermin蛋白家族相关的生物学功能的最新进展。

Fig.1：gasdermin家族

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Fig1:gasdermin蛋白家族。

A. 系统发育树显示了人，小鼠和大鼠gasdermin(GSDM)家族蛋白的差异。人gasdermin蛋白(GSDM)家族由6个基因编码，其总序列相似性范围为23.9~49.4%。这些家族可以被进一步细分，因为GSDME和pejvakin(PJVK)也属于耳聋相关基因(DFN)，这两类蛋白质序列聚在一起，远离其他人类gasdermins(GSDMA-GSDMD)。从进化角度来讲，GSDME和PJVK是最古老的gasdermin成员，在低等脊椎动物和一些无脊椎动物中也发现了相似的序列，但在蠕虫和苍蝇中没有发现。GSDMA基因序列存在于哺乳动物以及鸟类和爬行动物中，而GSDMB、GSDMC和GSDMD基因仅存在于哺乳动物基因组中，并且与GSDMA密切相关，这表明它们是通过基因复制产生的。小鼠和大鼠缺乏GSDMB，但除了Gsdmd，Gsdme和Pjvk外，小鼠还具有三个GSDMA同源物(Gsdma1-Gsdma3)和四个GSDMC同源物(Gsdmc1-Gsdmc4)。从结构上讲，gasdermins由两个不同的结构域组成，通过一个柔性连接区连接，除了PJVK呈现出一个较小的C-末端结构域(CT)。N末端gasdermin(GSDM NT)结构域在所有家族成员中显示出最高的序列相似性(相似性范围为28.8%至50.5%)。相比之下，C-末端gasdermin(GSDM CT)结构域呈现可变长度和较低的相似性(范围从1.3%到46.3%)。GSDM NT具有固有的成孔/诱导焦亡活性，而GSDM CT与GSDM NT相互作用，从而在没有活化信号的情况下抑制其活性。标度表示序列中每个氨基酸的替换次数。上述系统发育树由欧洲生物信息学研究所(EMBL-EBI)Clustal Omega tool 从UniProt序列生成的，并由Figtree软件版本1.4.3绘制。**

B. 人GSDMD和GSDME的结构域结构，其特征在于连接区中的caspase裂解序列(顶部)和膜插入的N-末端结构域(NT；底部)。

Box1：gasdermins的鉴定和表达模式

• gasdermin A(GSDMA；也称为GSDM，GSDM1或FKSG9)首先从小鼠皮肤中克隆发现，其表达主要局限于人的食管、膀胱和皮肤的上皮细胞。T淋巴细胞也能表达出可检测到的GSDMA蛋白。小鼠Gsdma1、Gsdma2和Gsdma3的表达也仅限于上皮和皮肤，包括表皮、毛囊和胃。
• GSDMB(也称为GSDML，PP4052或PRO2521)是通过使用GSDMA序列作为诱饵进行数据库同源性搜索发现的。GSDMB是gasdermin家族中最具分散特征的成员(另见图1a)，它不存在于小鼠和大鼠基因组中，尽管一些啮齿动物物种具有GSDMB同源的序列。GSDMB的表达主要在气道上皮，食道，胃，肝脏，小肠和结肠等组织中也检测到。已经在人类中检测到不同的GSDMB剪接可变体，其中一个转录本编码为GSDMB，在域间连接区(interdomainlinker)(由外显子6编码)中具有caspase 1裂解位点。过表达实验表明，caspase 1可以切割这种异构体并诱导裂解性细胞死亡。
• GSDMC(也称为MLZE)首先被鉴定为在转移性小鼠黑色素瘤细胞中表达上调的基因，后来被鉴定为gasdermin家族的成员。小鼠基因组包含四个Gsdmc同源基因。GSDMC的表达仅限于食管、皮肤、脾脏和阴道。人工截短的N端GSDMC(GSDMC NT)能够诱导焦亡，但是什么信号可以激活GSDMC以及如何激活GSDMC仍然不清楚。
• GSDMD(也称为GSDMDC1，DFNA5L或FKSG10)首先通过在人类基因组数据库中搜索GSDMA的同源物而鉴定出来的。GSDMD在不同的人类组织以及白细胞的不同亚群中广泛表达。GSDMD直系同源基因仅存在于哺乳动物基因组中，并且都包含一个大的中央结构域，具有caspase 1和小鼠caspase 11或人caspase 4和5的切割位点。然而，值得注意的是，在较低等的脊椎动物，例如斑马鱼中，caspase a(caspy)或caspase b(Caspy2)是人类caspase 1和人类caspase 4或5的同源物，据报道它们能诱导细胞死亡并参与免疫。这表明GSDMD的功能同源物可能存在于这些低等脊椎动物中，尽管不能排除存在其他替代的细胞死亡途径。在哺乳动物中，caspase 1切割前体pro-IL-1β，产生成熟的有生物活性的IL-1β细胞因子。同时，由caspase1、小鼠caspase11或人caspase4或5切割GSDMD导致形成高度裂解的GSDMD NT蛋白片段，其允许释放成熟的IL-1β(Fig. 2)。IL-1β的低级脊椎动物序列缺少保守的caspase 1切割位点，但是，尽管如此，鱼类caspase a，caspase b或IL-1β的抑制在感染期间对宿主是有害的。Gsdmd和pro-IL-1β在哺乳动物中都具有caspase 1切割位点，因此可以赋予炎症小体对IL-1β信号传导的两个关键步骤的调控，即其加工和释放。相比之下，这两个步骤可能由低等脊椎动物中的同源蛋白酶(如caspase a或caspase b)和GSDMD同源物控制。
• GSDME(也称为ICERE-1或DFNA5)最初被克隆为常染色体显性非综合征性听力损失的候选基因，后来被发现与gasdermins具有序列和结构上的相似性。GSDME在不同的人类细胞和组织中有不同的表达，包括脑、子宫内膜、胎盘和肠等。在小鼠和人类中，GSDME由caspase 3加工，它直接诱导或在细胞出现凋亡形态后间接诱导焦亡。
  GSDME在不同种类的低等脊椎动物中也有表达，例如，GSDME的两个同源基因(GsdmEa和GsdmEb)可以在硬骨鱼(bony fish)中找到。Caspase 3切割位点在斑马鱼GsdmEa中存在，但在GsdmEb中不存在，这表明GsdmEa可以被认为是GSDME的功能同源物。目前尚不清楚GsdmEb是否由鱼类Caspy或caspy2加工，但如果是这样，GsdmEb可能作为哺乳动物GSDMD的功能同源物(见上文)。有趣的是，斑马鱼中GsdmEb的缺失会导致耳朵的半规管畸形，这表明GsdmEb可能导致与人类GSDME相关的听力损失。
• Pejvakin(PJVK；也称为DFNB59或GSDMF)是另一种与耳聋相关的突变蛋白，但最初是从人类睾丸中克隆得到的。PJVK与GSDME高度相似，PJVK同源基因存在于早期脊椎动物和无脊椎动物中，这表明gasdermin蛋白家族可能是从这些祖先进化而来的。PJVK在睾丸中表达较高，但在其他组织中也广泛表达，包括内耳的毛细胞和听觉系统的其他细胞(TABLE 1)。到目前为止，还不清楚PJVK是否能够被蛋白酶处理，以及它的N末端或全长PJVK是否形成膜孔。

Fig.2：gasdermin D的经典和非经典炎性小体活化

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Fig. 2。gasdermin D在经典和非经典的炎症小体活化方面的作用。
A. 模式识别受体例如pyrin，AIM2，NAIP-NLRC4，NLRP3和NLRP1产生信号后，炎症小体复合物就会组装起来。这识别受体能识别PAMP，内源性危险信号或细胞死亡，损伤或感染引起的细胞稳态改变。
这些受体通过同型或异型PYD/CARD(caspase活化和招募结构域)相互作用来招募含有caspase募集结构域(ASC)的衔接蛋白凋亡相关speck样蛋白的，从而进一步招募pro-caspase 1或直接招募pro-caspase 1。caspase 1在炎症小体中被活化，并且caspase 1加工gasdermin D(GSDMD)以及pro-IL-1β和pro-IL-18等细胞因子。当细胞膜被GSDMD孔通透化时，细胞经历溶裂解、促炎性细胞死亡（焦亡），促进成熟的IL-1β和IL-18的释放。在没有细胞裂解的情况下，GSDMD孔还可以直接释放细胞因子，如IL-1α，危险分子，如高迁移率族蛋白-1(HMGB1)，甚至包括caspase 1在内的整个炎症复合物。

B. 非经典的炎症小体通路会导致小鼠caspase 11的活化（人类则是caspase 4和caspase 5）。来自革兰氏阴性菌的脂多糖(LPS)结合并诱导这些caspase的寡聚化和活化，使它们能够切割GSDMD。在第一步中，GSDMD孔允许钾释放，导致NLRP3炎症小体的活化和IL-1β/IL-18的成熟。在第二个步骤中，GSDMD孔导致焦亡，从而驱动成熟细胞因子的释放。由GSDMD孔引起的膜损伤通过运输(ESCRT)机制所需的内体分选复合体进行修复。

NAIP, NLR family apoptosis inhibitory protein; NLR , nucleotide- binding oligomerization domain, leucine- rich repeat- containing protein; NLRC4, NLR with CARD domain- containing 4; NLRP1/3, NLR with pyrin domain- containing 1/3.

TABLE 1:gasdermin表达谱

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gasdermin活化

在20世纪80年代和90年代，焦亡被认为是由毒素刺激或病原体感染诱导，并导致巨噬细胞由caspase-1介导的细胞死亡形式。后来的研究表明，促炎caspases（这是在炎症复合体中活化的一组proteases）的主要效应机制就是焦亡。炎症小体的活化有两种不同的途径，即经典炎症途径和非经典炎症途径，它们能识别病原体来源或宿主来源的危险信号，并开启人源caspase 1和caspase 4的活化或鼠源caspase 11的活化。这些caspases能够在GSDMD的中央连接区（人类中的是FLTD，小鼠中的是LLSD）切割GSDMD(Fig. 1b)，产生两个片段，一个是31kDa 的N末端GSDMD NT片段，该片段有着内在的成孔活性，另外一个是22kDa的C末端GSDMD CT片段，它能与GSDMD NT结合，作为抑制后者的抑制剂。GSDMD NT本身的表达就能诱导细胞焦亡，而GSDMD CT的过表达则会阻止细胞死亡。

这些结果就构建了一个caspase介导的GSDMD切割的模型，切割后生成的GSDMD NT从GSDMD CT的抑制中释放出来（也就是说，GSDMD NT与膜磷脂的结合后，分子内的相互作用就会很容易破坏细胞膜），因此诱导细胞的焦亡。其它的一些发现也支持了这个模型，gasdermin家族的成员多数都含有类似的结构（除了PJVK，pejvakin含有一个截短的C末端结构域），也就是说含有一个N末端细胞毒性结构域和一个C末端抑制结构域，这两个结构域由一个构件连接，异位表达GSDMA，GSDMB，GSDMC或GSDME的N末端结构诱导会诱导坏死(necrosis)，这种形式的细胞死亡在形态类似于GSDMD诱导的焦亡。因此，gasdermin家族作为一组新的细胞死亡效应因子就被发现了，这些效应因子由其能诱导N末端焦亡的形式来发挥作用。

GSDMD中含有caspase 1切割位点，而在其它的gasdermins成员中，除了GSDMB的一个较小的剪接突变体外，其余的成员并不含有这个位点，不过它们可能含有其它的protease切割的位点。事实上，人源和鼠源GSDME的连接区(Fig. 1b)含有一个caspase 3剪切基序(motif)，另外有研究指出，当受到凋亡刺激后，活化的caspase 3会在这个位点切割GSDME(Fig. 3)。根据这一发现，有人指出，当细胞已经以进入凋亡程序后，GSDME会导致细胞出现焦亡，丧失膜完整性。后来的研究则不同意该假设，并表明，尽管有些细胞在自然条件下含有高水平的GSDME，并表现出一些凋亡的特征，但是GSDME也还能直接诱导焦亡；另外还发现，Gsdme缺陷的巨噬细胞仍能通过某些未知程序，出现二级坏死(secondary necrosis)，进入凋亡程序。有意思的是，GSDME不是唯一在凋亡诱导后被活化的gasdermin成员。使用药物诱导或病原体诱导的激酶TAK1或抑制凋亡(IAP)，能够诱导GSDMD的切割，并且这一过程并不依赖于caspase 1和caspase 11。有人指出，在这种条件下，GSDMD直接由caspase 8切割(Fig. 3)，这与caspase 8可以在体外加工GSDMD的事实是相符的，尽管这一过程比较慢。也有人认为，由caspase 8驱动的GSDMD孔隙形成过程是造成凋亡细胞钾外流和NLRP3炎性小体活化的原因，但其它的发现指出，这一过程是由 pannexin-1通道活化的caspase驱动介导的。有意思的是，凋亡细胞中的GSDMD的活性受到caspase 3的负调控，caspase 3通过切割GSDMS的N末端结构域来发挥作用，进而产生失活片段。caspase 8活化GSDMD的生理功能和caspase 3的负调控作用还有待进一步确定。然而现在已经明确，GSDMD可以在“调亡”刺激后造成裂解性细胞死亡和炎症。

现在人们认识到，导致gasdermin活化的通路已经扩展到了caspase家族之外。两项研究表明，在活化的中性粒细胞中，细胞中的弹性蛋白酶(elastase)能切割GSDMD，这是一种丝氨酸蛋白酶，它对中性粒细胞的成熟和抗菌功能非常重要。虽然弹性蛋白酶在炎性caspases作用基序的上游几个位点处切割GSDMD，但是这种切割仍然能产生功能性孔形成片段。GSDMD在中性粒细胞中的精确机制现在仍然有争议。已经有研究发现，Gsdmd缺陷的小鼠对大肠杆菌更有抵抗性，这可能是由于中性粒细胞的寿命延长所致。另一方面，有人认为，GSDMD与中性粒细胞的死亡（注：原文中使用的术语是NeTosis，这是一种中性粒细胞的死亡方式）的有关。因此，GSDMD在中性细胞中同时发挥着好坏双重作用，这要取决于感染的类型以及是否需要中性粒细胞存活或死亡来限制病原体。

虽然诱导gasdermins活化的唯一已知生理机制就是蛋白水解，但是有几条证据表明，移除C末端gasdermin(GSDM CT)结构域并不是gasdermin活化的绝对条件。某些突变会导致自身抑制性结构域的相互作用被破坏，从而触发gasdermin的活化，这表明，C末端结构域本身的存在并不会干预孔的形成。GSDMA3的晶体结构揭示了结构域间相互作用的关键特征是GSDMA3 NT的α1螺旋和β1-β2发夹环，它们深入GSDMA3 CT的疏水核的凹槽里。GSDMA，GSDMA3，GSDMC，GSDMD和GSDME的C-末端结构域的疏水核心突变都会导致焦亡，并且导致脱毛的Gsdma3突变体的几个映射到C-末端结构域和结构域间相互作用界面。因此，生理信号通路有可能通过解除自身抑制，例如通过磷酸化或其他翻译后修饰，以类似的方式诱导gasdermin的活化。

Fig. 3：gasdermin被凋亡型caspase诱导的活化

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Fig. 3 “凋亡型”caspases诱导gasdermins的活化。

某些外部刺激，例如肿瘤坏死因子(TNF)或Toll样受体3和4的配体(TLR3和TLR4)，都能抑制凋亡抑制因子(IAP)蛋白，第二线粒体来源的胱氨酸酶活化剂(second mitochondria-derived activator of caspase,SMAC)模拟化合物或病原体诱导的TAK1激酶抑制可以促进激酶受体相互作用蛋白1(RIP1)依赖的胞质caspase 8激活复合物(复合物IIb/坏死性凋亡小体(Ripoptosome))的组装。活性caspase 8通过活化效应性caspase，如caspase 3来驱动细胞凋亡，但也切割gasdermin D(GSDMD)以产生活性N-末端片段。活性GSDMD可以诱导孔形成，但仅局限在天冬氨酸D87(小鼠D88)处受到caspase 3依赖的切割，从而产生GSDMD的非活性p20/p10片段。然而，caspase 3也可以切割和激活GSDME，从而在GSDME高表达的细胞中将细胞凋亡转化为焦化。GSDME诱导的焦亡不同于继发性坏死，继发性坏死以GSDMD/GSDME非依赖性方式进行。

FADD, Fas associated via death domain; SMAC, second mitochondrial- derived activator of caspases; TNFR1, tumour necrosis factor receptor 1; TRAM, TRIF- related adaptor molecule; TRIF, TIR domain-containing adapter- inducing IFNβ.

gasdermin的孔形成机制

焦亡的特征在于由gasdermin孔形成，进而引起的细胞膜破裂。体外结合试验表明，gasdermin N末端可以直接与膜脂相互作用。有研究报道，GSDMD NT优先靶向作用于酸性磷脂，例如磷脂酰肌醇和心磷脂，但也可以弱结合到磷脂酸和磷脂酰丝氨酸上。 其它的gasdermins例如GSDME，GSDMA和鼠源GSDMA3的N末端结构域表现出类似的脂质结合特性，这表明整个gasdermin家族具有共同的膜靶向机制。磷脂酰肌醇仅存在于细胞膜的细胞质小叶中。与此一致的是，N末端gasdermin(GSDM NT)结构域只能诱导细胞内的焦亡，在细胞外添加活化的gasdermin并不会造成细胞的膜裂解。心磷脂具有类似于磷酸肌醇的带负电荷的头部结构，它们存在于真核生物和细菌的线粒体内膜中。在大肠杆菌中表达GSDM NT结构域会表现出严重的毒性，重组GSDM NT蛋白可以裂解巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的原生质体。已经有研究表明，GSDMA3 NT和GSDMD NT单独或当不受分子内抑制时可以破坏线粒体，并且当细菌暴露于重组的GSDMD NT时，细菌的生成会受到抑制，不过还有待进一步的研究才能确定gasdermin的成孔结构域是如何进入内膜的。除了磷脂能够与GSDM NT结构域发生强烈的相互作用外，至于其它的膜脂结构，即使它们没有表现出与GSDM NT的特异性和强烈的结合，也有GSDM NT结构域通过影响膜的物理特性来发挥作用。例如，鞘磷脂的存在可以极大地促进GSDMD NT与脂质体的结合，而将胆固醇包在脂膜中则显著降低了与GSDMD NT的结合。虽然对于大多数gasdermins来说，只能用游离的GSDM NT结构域观察到脂质结合，但全长GSDMB则表现出与单独的GSDMB NT结构域类似的脂质结合能力，这表明GSDMB CT结构域不妨碍GSDMB的脂质结合功能。 除了磷酸肌醇结合外，GSDMB还与硫脂能特异结合，但这种结合的生理相关性仍有待确定。

考虑到所有GSDM NT结构域之间序列的高度相似性，因此可以推测出大多数（有可能不是全部）gasdermins使用类似的机制在膜中形成孔(Fig. 4)。全长GSDMA3的高分辨率晶体结构和最近鉴定的从重组脂质体(liposomes)中提取的GSDMA3 NT孔洞的低温电镜结构提供了一个很好的模板，让人们详细地来理解gasdermin形成的孔洞。在GSDMA3晶体结构中，GSDMA3 NT结构呈现出延伸的扭曲β片状结构，两侧有几个螺旋，这代表了一种在已知的成孔蛋白中未发现的新的球状折叠。

从β片的一端延伸出一个长环，连接到紧密并列在GSDM NT结构域一侧的螺旋GSDM CT结构域。在GSDM NT结构域内，螺旋α1和位于β片层结构凹侧的短β发夹与GSDM CT结构域具有密切的相互作用。在β片层的另一端，由两个柔性环持有的短螺旋从球状褶皱中突出，它们与GSDM CT结构域的另一部分相互作用(Fig. 4)。两个结构域间的相互作用将全长GSDMA3锁定到自抑制状态。当自抑制被破坏时，GSDM CT结构域从凹面释放，解除对GSDM NT的抑制，而GSDM NT结构域则以形成膜孔。

与自抑制状态相比，孔内的GSDMA4 NT结构显示出构象发生了强烈的变化，这种变化主要存在于两个结构元件中。在自抑制结构中与GSDM CT结构域接触的短螺旋连同其侧翼环一起重新折叠成两条β链，形成一个β发夹。在邻近区域，另一条β链及其侧翼环也重新折叠成β链，并形成一个额外的β发夹。四个新形成的β链各自与核心β片层结构中的现有β链合并。两个反向平等的β发夹形成了一个长的四链双亲性β片层结构，这个结构从gasdermin N末端结构域的核心球状折叠延伸中伸出去。

这些构象变化会产生三个寡聚界面，驱动GSDM NT结构域形成环状孔结构，并伴随着两亲性β片层结构绑定在一起，组装成一个插入膜中的β桶结构。β桶或寡聚界面上的突变，例如GSDMD中的E15K和L192D突变会严重操作GSDM NT结构域的成孔活性。每个GSDMA3孔包含大约26-28个GSDM NT原聚体(promoters)，不过多数都是27倍原聚体(Fig. 4)。GSDMA3孔的内径约为18 nm，外径约为28nm。GSDMD孔的并不均一，它们的内径在10到20 nm之间，这表明由不同GSDM NT结构域形成的孔中存在着环境依赖的化学计量。GSDMD孔的尺寸足够大，这样在经典炎症小体中活化过程中生成的成熟的IL-1β就能流出来。

导致孔形成的构象变化是由GSDM NT结构域与膜磷脂的结合触发的。在GSDMA3孔的低温电子显微镜结构中观察到了可能的脂质结合位点。在螺旋α1和插入膜的β片层之间的根部和带正电荷的口袋中电子密集，心磷脂的头部基团中也有类似的电子密度，也被用于重建GSDMA3孔。该口袋的表面被自抑制GSDMA3结构中的GSDM CT域完全掩蔽。由于结构域间切割不能解锁自抑制相互作用(GSDMD和GSDME)，因此仍有待研究带电的磷脂头如何能够进入完全掩埋的口袋从而触发随后的构象变化。或者说，在GSDM NT结构域中可能存在另一个脂质结合位点，该位点具有与膜中磷脂完全结合的启动作用。在GSDMA3孔中观察到的结构变化使人想起膜攻击复合体穿孔素样/胆固醇依赖性细胞溶解素(MACPF/CDC)家族中所观察到的结构变化，尽管两种类型的孔形成蛋白的总体结构非常不同。对于MACPF/CDC家族来说，单体成孔结构域在随后的构象变化之前寡聚成可溶性的前孔结构(pre-pore)，从而介导膜插入和成熟孔的形成。利用高分辨率原子力显微镜，最近的一项研究分析了GSDMD孔隙形成的动态过程，研究发现GSDMD NT单体嵌入脂细胞膜并组装成弧形或狭缝状中间寡聚物，然后生长为环状跨膜孔(Fig. 4)。该过程是连续的，并且不涉及前孔结构的过渡阶段，这不同于MACPF/CDC家族的特征。

Fig.4：gasdermin膜的插入和孔形成机制

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Fig. 4 gasdermin膜插入和孔形成的机制。N-末端gasdermin(GSDM NT)和C-末端gasdermin(GSDM CT)结构域之间的相互作用使蛋白质保持在自抑制状态。在GSDMNT结构域内，螺旋α1和位于β片层结构凹侧的短β-发夹与GSDM CT结构域产生紧密的相互作用。此外，从β片层的一端延伸出一个长环路与GSDM CT连接。一旦自身抑制被破坏，通过哺乳动物caspase 1，小鼠caspase 11或人caspase 4/5和GSDME切割gasdermin D(GSDMD)的机制，GSDM CT从凹面释放，从而释放GSDM NT，后者用于膜插入和孔形成。膜靶向需要具有带负电荷头部基团的磷脂，就如在细胞膜的内叶上发现的那样。与自抑制状态相比，GSDM NT的孔构象显示出剧烈的构象变化，这涉及到新的β链与扭曲的β片层结构合并的重新折叠。这些变化还会产生新的寡聚界面，驱动跨膜的β桶，即GSDM NT孔的组装。从结构角度来看，gasdermin可以在没有结构域间切割的情况下通过破坏分子内抑制的机制来活化。

gasdermin孔形成后的结果

在细胞膜上形成的gasdermin孔通常会导致由于孔诱导的膜裂解而导致的细胞坏死。考虑到不同的信号和细胞环境，不同细胞或不同细胞群体的gasdermin孔的数量和大小可能不同，这就导致了不同的细胞死亡依赖或细胞死亡无关的细胞效应。

亚溶解孔形成

虽然在实验体系中，gasdermin孔最终会导致焦亡，但是细胞裂解并非总是这些孔的主要功能。到目前为止，这种“非依赖裂解”的功能仅在GSDMD孔方面提到，不过其它gasdermin家族的成员也有可能有类似的机制。例如，研究表明，GSDMD孔的形成可能由于细胞类型，GSDMD表达水平，活化和时间以及对抗机制的效率而有所不同。例如在小鼠巨噬细胞中，用细菌肽聚糖的N-乙酰氨基葡萄糖片段或OxPAPC能诱导NLRP3炎性小体的活化，即在没有出现细胞裂解的情况下，还是会出现GSDMD依赖的活细胞中IL-1β的释放。类似的，在炎性小体活化时，LPS能诱导人单核细胞释放IL-1，以及诱导中性粒细胞非裂解形式(lysis-independent)的IL-1释放。这些研究表明不仅表明了会出现亚裂解形式的GSDMD孔的形成，并且亚裂解形式的GSDMD孔也许是一种直接的，非常规形式的释放的IL-1β和IL-18的释放途径，从而可以使在细胞不发生裂解时能释放这两种细胞因子。

gasdermin孔的这种非溶解依赖的功能或许也有可能释放其它蛋白质或参与信号通路的调控。GSDMD相对较大尺寸的孔可以直接释放IL-1β和IL-18（这些细胞因子的分子直径约为5nm）以及其它小的胞质蛋白，例如小GTP酶，半乳糖凝集素或半胱氨酸内肽酶抑制剂cystatins。此外，由于gasdermin孔是大的、非选择性的膜通道，由gasdermin孔引起的离子流出甚至在细胞死亡之前就可以对细胞信号通路产生深远的影响。例如，由GSDMD孔引起的钾流出在LPS诱导的非典型炎症途径活化后触发NLRP3的活化。由于钾驱动的NLRP3活化是一种细胞内在机制，因此钾外流和NLRP3活化必定在细胞经历GSDMD驱动的焦亡之前发生。类似地，有人提出，在嗜肺军团菌以亚裂解形式活化AIM2炎性小体后，GSDMD依赖的钾流出活化NLRP3，并且钾流出损害IFN-I应答，而与最终细胞的死亡无关。

那么，细胞是如何调节gasdermin的活化或孔形成的水平，以及膜上孔形成的过程是可逆的么？干扰素调节转录因子IRF2能强烈上调GSDMD的表达，这可能使处于休眠状态的细胞保持低水平的GSDMD，从而避免细胞死亡。此外，不同细胞类型和活化触发器之间的caspase的活性有很大差异，这也可能是导致亚裂解型GSDMD活化的条件。此外，对成孔毒素或机械或激光诱导的膜损伤的研究表明，细胞膜损伤不是一个最终事件，并确定了几种类型的膜修复机制，它们可以在几秒钟或几分钟内恢复膜的完整性。参与修复机制的一些蛋白被招募到细胞膜上，从而对Ca2+通过GSDMD孔的内流产生应答，并促进含有受损膜的囊泡的出芽以及释放。在中性粒细胞或亚裂解型炎性小体活化过程中，ESCRT或其它的膜修复系统是否活跃还需要进一步的证明。

需要注意的是，ESCRT或其它膜出芽机制释放的囊泡可能代表了非常规的蛋白质分泌的替代途径。在早期关于炎性小体活化的研究发现，在炎性小体活化后不久，外泌体脱落增加，并且可以在炎性小体活化的细胞外泌体中发现成熟的IL-1β。最近的研究还发现，类似的外泌体形成与外泌体介导的IL-1β的释放依赖于GSDMD。这些囊泡是否能以非特异性的试释放胞质蛋白或IL-1β和其它蛋白质是否优先包装到这些囊泡中还有待进一步的研究。总体而言，根据GSDMD的活化水平，gasdermin孔作为非常规蛋白分泌的主要调节器，通过直接膜转位(孔功能)、囊泡释放(诱导膜修复)或通过膜裂解的被动释放(焦亡)来促进无导(leaderless)蛋白的释放。

焦亡型细胞死亡

在大多数情况下，GSDMD加工水平和GSDMD孔形成的增加最终将克服调节机制并诱导细胞死亡。这种由炎症caspase的活化控制的特定类型的导致细胞坏死的开启类型最初被称为焦亡；然而，由于所有的GSDM NT结构域都可以在没有caspase活化的情况下诱导焦亡，因此术语“焦亡”已经被重新定义为一种以gasdermin依赖型的细胞死亡形式(Box 2)。在细胞培养中，焦亡细胞的特征是广泛的胞膜空泡化，随后膜膨胀，最终膜完整性丧失，这可能是由于渗透溶解导致的。导致细胞裂解的精确事件尚不完全清楚，可能gasdermin在细胞器膜，例如线粒体或核膜上形成了孔，这一事件有助于诱导细胞死亡以及导致焦亡细胞发生形态学上的改变。例如，GSDMD NT与心脏脂质结合，并被发现它线粒体膜为靶点，并且能增强活性氧的生成。GSDMA3 NT也能够损伤线粒体并诱导线粒体自噬。在中性粒细胞中，GSDMD已被证明能与核膜结合并破坏它，从而在NETosis期间促进DNA的分泌。因此，即使在高效的细胞膜修复的条件下，影响细胞内细胞器的gasdermin孔仍可能导致细胞死亡。

体内的焦亡型细胞死亡证据源于对于自身炎症冷卟啉相关周期性综合征(CAPS)患者的研究，研究发现，在患者的炎症爆发时，能在患者的血液中系统地检测到炎症寡聚体，这表明潜在的细胞焦亡伴随着活化的炎症小体。从冷卟啉相关周期性综合征患者体内分离单核细胞，使用炎症小体激动剂来刺激该细胞，就能发现一小部分细胞表现出炎症小体标记物的阳性结果，这说明，并非所有的单核细胞都会出现焦亡。由GSDMD驱动的焦亡也被证明能够影响冷卟啉相关周期性综合征的小鼠模型的疾病严重程度。至于焦亡在体内参与疾病以及宿主防御的功能方面，还需要更多的研究。

焦亡通常指的是一种炎症形式的细胞死亡，发生焦亡的细胞释放出大量的分子，这些分子能发生“找我”的信号，并且呈递“吃我“的信号，例如磷脂酰丝氨酸。因此，可以推断，通过胞吐(efferocytosis)作用可以有效地除去焦亡细胞的残留物。然而，焦亡形式的细胞死亡与坏死形式的细胞死亡不同，在多数情况下，焦亡是由炎症caspases引发的，因此焦亡的过程伴随着IL-1β和其它IL-1家族成员的释放。这些细胞因子的释放有可能是导致GSDMD依赖性的焦亡表型，并使其与坏死区分开来。但是，现在不能排除焦亡的细胞也能释放其它独特的危险信号分子，这些信号分子是在细胞器破裂或caspase活性的过程产生的。一些研究已经鉴定了与焦亡相关的分泌组(secretome)，鉴定了在caspase 1活化和细胞膜通透人时时释放的900多个蛋白质。然而，目前还没有系统的研究将焦亡的分泌组和免疫学结果与其他类型的细胞死亡进行比较。总之，现在可以假设焦亡能导致不同的免疫学结果，导致低水平或高水平的炎症反应(Fig. 5)，并且这种炎症应答将取决于活化的gasdermin的类型，活化的机制(蛋白酶驱动或其他驱动)，执行焦亡的细胞环境和细胞类型，以及gasdermin损伤介导的膜修复效率。

Fig.5：gasdermin孔形成以及焦亡的免疫学结果

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Fig. 5 gasdermin孔隙形成和焦亡的免疫学结果。焦亡细胞释放大量细胞内分子，这些分子可以通过充当警报器和“找到我”信号来活化免疫系统。
A. 如果gasdermin孔被修改并终止了gasdermin活化信号，那么细胞内容物的释放可能是短暂的，并且仅限于能够穿过gsdermin孔的小分子(损伤相关的分子模式(DAMP))。
B. 在病原体或激活NF-κB的损伤相关信号存在的情况下，核苷酸结合寡聚结构域、富含亮氨酸重复和含Pyrin结构域的3(NLRP3)炎症小体就会活化焦亡，并与caspase 1的活化和促炎细胞因子(IL-1β，IL-18)的释放以及穿过gasdermin毛孔的小细胞内蛋白(DAMP)有关。在这种情况下，如果没有修复细胞膜上的gasdermin孔，则随着促炎细胞因子释放的激增，以及大量细胞内成分(如炎症小体寡聚体)的释放，最终会以导致促炎性焦亡。因此，焦亡最有可能导致不同的免疫学结果，导致低水平或高水平的炎症反应。

GSDMD, gasdermin D; PAMP, pathogen- associated molecular pattern.

Box 2：焦亡：一种由gasdermin诱导的坏死型细胞死亡

焦亡这个术语最初是根据其形态学特征和对caspase 1的严格而特异性的要求而定义的，它被定义为“caspase 1依赖性坏死”。焦亡这个词的英文是pyroptosis，它最初来源于希腊语，其中pyro的意思是“火”或者“发热”，ptosis的意思是“落”（注：这里的“落”可以理解为树叶落下这个动作，跟凋亡的英语apoptosis中的后缀ptosis一样），这两个部分构成了pyroptosis，意思是强调这种细胞死亡形式的特征是伴随着促炎发生以及成熟的IL-1β和IL-18的释放。随后在2002年鉴定了炎症小体复合物，以及在2011年发现了非典型炎症小体通路，焦亡又被重新定义为炎症小体依赖性细胞死亡以及炎性小体的效应机制。然而，现在的研究也明确发现，焦亡并不一定伴随着成熟的IL-1β和IL-18的释放，因为即使在没有caspase 1的情况下，小鼠caspase 11和人caspase 4诱导的具有所有特征的形态学特征也会诱发焦亡。这一点通过鉴定GSDMD作为焦亡的唯一执行者而进一步得确认。并且实验表明，GSDMD或其他gasdermins的N-末端结构域的表达足以诱导焦亡，而不需要caspase的活化。

更多的报道已经开始从炎症caspase和炎性小体中研究焦亡和gasdermin活化。例如，研究表明，中性粒细胞弹性蛋白酶和caspase 8可以切割和激活GSDMD以导致细胞死亡，并且caspase 3加工GSDME也可以导致焦亡型细胞死亡。由于在所有情况下，细胞死亡在形态上类似于焦亡，并且依赖于gasdermin家族成员的活化，因此似乎很明显，焦亡这个术语需要重新定义。因此，我们建议将“焦亡”定义为“gasdermin诱导的坏死型细胞死亡”，并将此术语应用于所有可通过诱导膜通透化而导致细胞死亡的gasdermin家族成员。我们建议可以将这个术语独立地使用于涉及了gasdermin激活的实际机制和它发生的细胞类型中(We also suggest to use this term independently of the actual mechanism of gasdermin activation and the cell type in which it occurs.)。我们承认上游信号事件或受影响的细胞类型可以改变焦亡刺激炎症或免疫反应的能力（由caspase 1引起的焦亡涉及成熟的IL-1β的释放，而GSDME依赖的焦亡可能不会），这与活化机制有关，与作为细胞死亡执行者的gasdermins的功能无关。

gasdermins在疾病方面的作用

在不同的病理生理条件下，gasdermin家族发挥着重要的，以及各种功能的焦亡作用，因此gasdermin家族可能在机体的健康和疾病中发挥了重要作用。事实上，事实上，第一个gasdermin基因就是因为其在小鼠皮肤病中的作用才被克隆出来的。随着2015年首次发生gasdermin在焦亡和炎症小体活化中的作用，现在已经涌现了很多研究gasdermin活化与各种疾病关系的文献。

gasdermin A

GSDMA的在胃肠道和皮肤中高表达，但在原发性胃癌和胃癌细胞系中不表达。早期的研究表明，恢复人胃癌细胞系中的GSDMA表达可以增加其对转化生长因子-β(TGF-β)诱导的凋亡的敏感性。然而，GSDMA在癌细胞中的促死亡活性是否需要切割以及GSDMA在健康胃上皮细胞中的生理功能尚不清楚。如上所述，GSDMA3 NT在培养的细胞中的表达后，它会通过细胞膜通透化(permeabilization)来诱导细胞死亡。有趣的是，在这一过程中，还存在LC3-II的上调，这是自噬途径的标记，这表明GSDMA3诱导的自噬可能与自噬成分的活化同时发生，但其潜在机制以及GSDMA3 NT诱导自噬的生理相关性仍有待确定。GSDMA3 NT诱导的细胞死亡可以通过共表达GSDMA3 CT而被抑制，这一现象类似于该结构域在其他gasdermins中发现的抑制功能。Gsdma3的不同突变体与皮肤相关表型相关，其中就包括角质形成和脱发。然而，Gsdma3-/-小鼠没有表现出明显的皮肤发育异常，这表明这些突变赋予了突变体蛋白新的功能。皮肤中Gsdma3的生理功能似乎与毛发的发育有关。Gsdma3中的功能获得突变(gain-of-function)被发现能破坏GSDMA3的自身抑制，从而使GSDMA3 NT结构域诱导焦亡。在过表达GSDMA3 NT的细胞中能观察到线粒体活性的下降。然而，目前尚不清楚GSDMA3 NT和/或GSDMA3的功能获得突变是否可以直接靶向作用于线粒体膜并形成孔，从而导致线粒体衰竭并促进线粒体自噬和焦亡。

gasdermin B

现已发现GSDMB与肿瘤进展有关，其在胃癌、宫颈癌和乳腺癌以及肝癌中的表达上升。在人类表皮生长因子受体2(HER2；也称为ERBB2)阳性的乳腺癌患者中，肿瘤细胞中GSDMB基因表达增加与预后不良、生存率降低和转移增加有关，也与HER2靶向治疗的不良治疗反应有关；同时，GSDMB被发现与ERBB2有共表达。GSDMB在人类中有几种剪接体，GSDMB异构体2(isoform)与乳腺癌细胞中的促瘤性(pro-tumorigenic)和促转移性表型(pro-metastatic)密切相关。目前尚不清楚GSDMB如何促进癌细胞存活的，因为GSDMB NT在培养的细胞中过度表达时能够诱导细胞焦亡。

不同的全基因组关联研究也揭示了某些GSDMB单核苷酸多态性与疾病易感性增加之间存在着相关性，如哮喘、克罗恩病和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis)。全长GSDMB和GSDMB NT结构域都可以与磷脂酰肌醇和巯基糖脂硫脂结合。事实上，GSDMB也被认为在硫脂的细胞运输方面发挥作用，研究表明GSDMB CT内的单核苷酸多态性可以导致GSDMB结构的改变，从而影响细胞内的硫脂水平。他研究发现，GSDMB的剪接异构体(splice variant)与哮喘风险较低有关。这个异构体缺少编码caspase 1裂解位点的外显子，因此影响GSDMB诱导气道上皮细胞的焦亡能力。要充分了解GSDMB在癌症、感染和自身免疫性疾病中的作用还需要进一步的深入研究。

gasdermin C

GSDMC最初被发现在转移性黑色素瘤细胞中高表达，因此最初被命名为黑素瘤衍生亮氨酸拉链额外核因子(MLZE)。最近有报道称，GSDMC敲除后能降低结直肠癌细胞系的增殖，这为GSDMC的促肿瘤作用提供了进一步的证据。然而，另一项研究表明，GSDMC在许多食管鳞状细胞癌中的表达受到抑制，这表明它可能是肿瘤抑制基因。因此，到目前为止还没有关于GSDMC是否促进或抑制癌症发展，以及这一功能是否需要其N-末端成孔结构域活化的研究报道。

gasdermin D

体外研究表明，GSDMD是非典型炎症途径下游细胞死亡的唯一执行者。然而，值得注意的是，由于存在ASC焦点刺激的备用细胞死亡程序或更混杂有caspase 1的蛋白水解活性，因此GSDMD的缺失并不能完全消除经典炎症小体活化后的细胞死亡。在活体实验方面，研究表明Gsdmd-/-小鼠与Casp11-/-小鼠一样，对LPS诱导的致死性具有类似的保护作用。此外，Casp11-/-和Gsdmd-/-小鼠肠沙门氏菌亚种(Salmonella enterica subsp)或肠血清鼠伤寒沙门氏菌(TyphimuriumΔSifa)和流产布鲁氏菌(Brucella Abortus)的感染均表现出易感性增强，这两类细菌都能活化非经典炎症小体通路。相比之下，在感染新凶手弗朗西丝氏菌(Francisella novicida)方面，Gsdmd-/-小鼠比CASP1-/-或AIM2-/-小鼠抵抗力更强。同样，据报道，感染鼠伤寒沙门氏菌(S. Typhimurium)的gsdmd-/-小鼠的腹腔IL-1β水平高于casp1-/-casp11-/-小鼠。然而，Gsdmd缺乏症完全保护了携带有Pyrin家族性地中海热(familial Mediterranean fever)相关的Mefv V276A等基因的小鼠免受自身炎症疾病的发展，并且在表达有NLRP3的D301N功能获得突变的小鼠中完全消除了所有新生儿期发病多系统炎性疾病(neonatal onse multisystem inflammatory disease,NOMID)相关的炎症症状。因此，GSDMD可能在体内发挥环境依赖性作用，并且在某些情况下，Gsdmd-/-动物可能参与替代的细胞死亡途径，从而允许保护动物免受典型炎症小体活化后的微生物攻击。

gasdermin E

GSDME最初报道为与人类非综合征性听力损失相关的基因。所有已知的GSDME突变跳过了外显子8，从而产生具有细胞毒性的截短蛋白。由于GSDME NT具有重组后活性和跳过外显子8导致GSDME CT阻遏结构域的破坏，因此可以假设GSDME相关的听力损失是由细胞死亡引起的。然而，由于GSDME在多个组织中表达，目前尚不清楚为什么内耳细胞在GSDME自动活化时优先经历细胞死亡。一种合理的解释是，由于移码突变，从而导致了编码与听力有关的某个蛋白的尾部出现了41个残基的非自然序列，使得正常的蛋白被截短，而这个截短的蛋白对蛋白酶体的降低非常敏感；因此，该蛋白的剩余低水平仅足以损害听觉系统。或者说，GSDME的不同表达水平和不同细胞类型中截短的突变体的降解途径存在差异，这都有可能导致一些细胞对耳聋突变更具抵抗力。

GSDME的生理活化机制可能涉及caspase 3的切割。激活caspase 3的化疗药物，如拓扑替康(topotecan)、依托泊苷(etoposide)、顺铂(cisplatin)和CPT-11，随后被证明可诱导那些高表达GSDME的细胞系的焦亡型死亡，而这些药物则诱导GSDME阴性细胞的凋亡。因此，表达低水平GSDME的小鼠骨髓来源的巨噬细胞在诱导凋亡时不会经历GSDME依赖的焦亡，即使这一过程存在着GSDME的加工。然而，GSDME可能是化疗治疗中一些副作用出现的原因，因为与野生型小鼠相比，Gsdme-/-小鼠更能抵抗顺铂注射引起的组织损伤和体重减轻。因此，GSDME有可能以细胞类型特异性的方式将细胞凋亡转化为细胞焦亡型死亡。

Pejvakin

PJVK突变也与人类和小鼠的听力损伤有关。与导致常染色体显性听力损失的GSDME突变不同，PJVK的所有已知突变都会造成常染色体隐性听力损伤，这种受损是由于功能障碍的外毛细胞(outer hair cells)引发的。有趣的是，研究表明Pjvk-/-小鼠表现出早发性进行性听力损失的听觉表型，类似于携带PJVK突变的患者。这与所有其他gasdermin家族成员不同，在gasdermin家族中，敲除小鼠没有显示出肉眼可见的表型，这表明PJVK的突变实际上导致了功能丧失型表型(loss-of-function)。虽然尚未证明PJVK NT结构域在孔形成方面的功能，但其生理功能可能需要PJVK即使在没有刺激的情况下也持续活跃，即形成孔。事实上，PJVK CT结构域要短得多，并且与其他gasdermin家族成员没有明显的同源性(参考Supplementary Figure 1)，因此PJVK CT结构域可能无法充当抑制性结构域。有趣的是，有人提出PJVK定位于内毛细胞中的过氧化物酶体的膜上，并且它能直接招募自噬蛋白LC3B来驱动在噪声过度暴露时引起的氧化应激之后，由自噬介导的受损过氧化物酶体(Pexophagy)的清除。PJVK驱动的pexophagy随后就是过氧化物酶体的增殖，从而保护听觉毛细胞免受氧化损伤。事实上，Pjvk-/-小鼠表现出过氧化物酶体功能障碍和抗氧化防御受损的迹象，并且Pjvk-/-毛细胞中的过氧化物酶体在听觉诱发后就显示出结构异常。有人认为，这有助于Pjvk-/-小鼠和携带有PJVK突变的人对声音的异常易感性，从而导致进行性听力损失。

抑制gasdermins与治疗

鉴于GSDMD在炎症小体诱导的细胞死亡和细胞因子释放中的关键作用，针对gasdermin孔的抑制正在成为抗炎治疗的新靶点。抑制焦亡作用的思路来自于对这种类型的细胞死亡的初次研究，研究表明细胞的裂解可以被渗透保护剂(osmoprotectant)或高浓度的甘氨酸(在毫摩尔范围内)阻断。然而，这一策略并不阻止分子直接通过GSDMD孔隙(如摄取染料或IL-1β释放)，因此不适合于靶向GSDMD的相关炎症。第一种被发现能够阻止焦亡和IL-1β释放的化合物是石榴多酚(Penicalagin)，这是一种在石榴中发现的复杂的抗氧化剂多酚。石榴多酚能可逆地抑制细胞膜通透性和caspase 1活化后成熟的IL-1β和IL-18的释放，在低微摩尔范围内具有半最大抑制浓度(IC50)，而不影响GSDMD NT的产生。石榴多酚不影响NLRP3或AIM2炎性小体活化，但能阻断细胞膜的流动性，并可能干扰GSDMD NT正确地插入细胞膜，阻止其寡聚化和/或孔的形成。最近，一份报告表明，石榴多酚影响NlrP1和NLRC4炎性小体的活化；然而，由于石榴多酚以干扰细胞膜流动性和外源颗粒和蛋白质的摄取，因此在刺激前应用时，它也可能干扰细菌性炎症小体活化剂(如鞭毛蛋白或炭疽致死因子)向细胞的传递。因此，需要进一步的研究来了解石榴多酚的作用机制及其对GSDMD的潜在特异性。体外实验表明，经石榴多酚清洗后，可以观察到快速的细胞溶解，这种溶解可以被镧系元素(La3+和Gd3+)所阻断。这些金属化学元素也被发现能抑制巨噬细胞中在焦亡前细胞膜孔的形成。然而，镧系元素是否影响细胞膜上的GSDMD NT寡聚化尚不清楚，因为它们不能阻断IL-1β释放。

最近报道了几种化合物能直接靶向GSDMD。例如，necrosulfonamide(NSA)是一种先前已知的半胱氨酸反应性药物，此化合物能够抑制坏死性凋亡(necroptosis)中人混合系列蛋白激酶样结构域(MLKL,mixed-lineage kinase domain-like pseudo- kinase)，它也能抑制人源和鼠源细胞的焦亡。NSA与GSDMD结合并抑制细胞膜上的GSDMD NT的寡聚化，但不影响Toll样受体信号传导、炎症小体的活化、GSDMD的裂解或细胞因子的成熟。在低微摩尔范围内，NSA能阻断炎症小体活化时的细胞膜通透性和IL-1β释放，并保护小鼠免受内毒素诱导的小鼠感染。从机制上讲，NSA能共价修饰GSDMD的Cys191，这是孔形成所必需的残基。有趣的是，NSA不影响GSDME NT诱导的细胞死亡，这与GSDME中同样的位点缺少一个半胱氨酸的效应是一致的。另一种化合物是LDC7559，据报道该化合物可抑制在小鼠或人类细胞中发生的弹性蛋白酶依赖性的NETosis或焦亡，但其作用机制至今尚不清楚。

结论与展望

自从GSDMD被鉴定为焦亡的执行者以来，我们对这个新兴的细胞死亡执行者家族的了解取得了快速的进展。对全长gasdermins的结构和诱变以及GSDMA3 NT孔隙的结构研究已经揭示了自抑制和膜插入的机制。此外，大量研究表明，在炎症小体诱导的焦亡之外，gasdermins还参与细胞死亡，例如在出现典型的凋亡形态后发生后的NETosis和坏死死亡过程中。另一方面，对gasdermin孔隙的非裂解功能的鉴定扩展了gasdermins的已知功能，提示了gasdermin在非常规蛋白质分泌中的关键作用。

很明显，这些研究只是冰山的一角，在未来几年中，gasdermin家族将成为免疫、癌症治疗和其他领域的核心参与者。然而，许多问题仍未得到解答。例如，了解不同gasdermins的活化机制，哪些细胞类型能产生这些活性gasdermins，以及它们将引发什么生物学效应，这都是非常重要的问题。目前尚不清楚不同的GSDMB和GSDMC是否具有不同的作用(GSDMB和GSDMC的功能在很大程度上是未知的)，以及是否所有的GSDMB都具有炎症和宿主防御微生物感染方面的功能。

随着知识的进步，gasdermin活性的药理调节有可能成为治疗具有炎症成分的不同疾病的关键。特异性gasdermin阻滞剂的表征以及验证焦亡是一个可行的药理学靶点才刚刚开始。在许多体内模型和临床试验中，已经用化学抑制剂或阻断抗体证实了阻断炎性小体-IL-1途径在临床方面的意义，针对IL-1的阻断抗体已经被批准用于治疗自身炎症和慢性炎症性疾病。新型gasdermin阻滞剂的开发不仅对理解焦亡孔在不同疾病中的作用具有重要意义，而且还将为开发新的炎症性疾病治疗方案铺平道路。