RNA-seq数据和microassay在差异表达分析上的区别:
- RNA-Seq观察到的数据是抽样过程中产生的离散（discrete) count形式。也就是说总体是恒定的（测序深度是恒定的），表达量越高的基因在抽样结果中所占的比例越大。表达量低的基因可能即便有也无法被检测出来。当然重新对相同文库进行测序，还是有可能找到更多表达的转录本
- microassay检测的是荧光信号的连续度量。由于使用固定的核酸序列去交。所以不是一种"零和游戏"，只要能杂交，就能被检测。（但如果没有设计相应的引物，就不能检测到可能的基因)
RNA-Seq的概率分布
image
RNA-Seq是目前基因表达分析最常用的技术。分为以下几步
- 分离所有mRNA
- 逆转录mRNA成cDNA
- 对cDNA测序
- 比对参考基因组
RNA-Seq实验设计中的“重复”包括：技术重复和生物学重复
重复是为了检测组间和组内的变异，对于假设检验至关重要。
技术重复为了估计测量技术（RNA-Seq）的变异。
生物学重复是为了发现生物组内的变异。
简单的说，两组的基因表达的变化只有比组内变异还大时才能认为时显著的。
- 相同基因在不同细胞的表达水平服从log-normal(对数正态)分布，由定量PCR验证。 (注:这与相同细胞不同基因表达的分布不同）但是大多数基因表达实验都是用一群细胞，几乎没有相应分布提出。
- RNA-Seq试验中，抽样得到的raw read counts服从泊松分布。并且同一样本在两次试验中的结果不同，这称为shot noise。这种变异在RNA-Seq技术重复间称为Possion noise。
- 生物学上不同的样本间的差异服从负二项(negative binomial)分布,有时称gamma-Poisson分布。
- 由于RNA-Seq count数据也表现出zero inflation(大量值为0)的特征，所以很难拟合到负二项分布，所以有文章认为要用Poisson-Tweedie family建模。
研究意义
在不同背景下比较mRNA水平
同一物种，不同组织：研究基因在不同部分的表达情况
同一物种，同一组织：研究基因在不同处理下，不同条件下的表达变化
同一组织，不同物种：研究基因的进化关系
时间序列实验： 基因在不同时期的表达情况与发育的关系基因分类： 找到细胞特异，疾病相关，处理相关的基因表达模式，用于诊断疾病和预测等
基因网络和通路： 基因在细胞活动中的功能，基因间的相互作用。
