影响因子：5.215

研究概述：

特异性糖蛋白可作为人类癌症的生物标志物。多数免疫检查点是膜糖蛋白，它们的糖基化可能改变免疫系统对肿瘤的感知，影响机体的抗肿瘤免疫。

本文讨论了肿瘤免疫中涉及的免疫检查点的糖基化修饰，介绍了小非编码RNA的糖基化，以及糖基化靶向免疫治疗的最新进展。

1糖基化定义

PTM（翻译后修饰）是指蛋白质中特定氨基酸残基的化学修饰，包括糖基化、磷酸化、甲基化、乙酰化、泛素化等过程，是影响蛋白质活性或表达水平的关键。糖基化是其中最丰富多样的一种，是调节多种生理和病理功能的重要细胞机制，包括14个不同的类型：N-糖基化、11种O-糖基化、C-甘露糖基化和生成GPI锚定蛋白，其中N-糖基化和O-糖基化最常见。

2.蛋白质糖基化的过程

糖基化由复杂的生物合成途径产生，主要过程涉及：糖链通过糖基转移酶催化转移到蛋白质，在聚糖和氨基酸残基之间形成糖苷键。蛋白组装是通过一系列转运、糖链末端剪切、岩藻糖基化或唾液酸化完成的。大多数糖基化发生在内质网ER，并在高尔基体结束。除黏蛋白型O-糖基化外，从高尔基体开始的糖基化很少。

2.1 N-糖基化过程

作为连接点，N -糖基与天冬酰胺的酰胺基、N末端氨基酸的α-氨基以及赖氨酸或精氨酸的ω-氨基形成N -糖苷键。包含两个催化亚基SST3A和STT3B的多单元寡糖转移酶(OST)复合物催化这一过程。这是真核细胞内质网中含量最多、保守性最好的蛋白修饰。

ER中错误折叠的蛋白质通过ER相关降解(ERAD)转移到细胞质基质中进行蛋白酶体降解。对ERAD耐药的错误折叠蛋白因太大而无法穿过ER膜，故被运送到内溶酶体进行ER-溶酶体相关降解(ERLAD)。这两种降解途径均被证明与N-聚糖有关。

2.2 O-糖基化过程

O-糖基化发生在高尔基体中，形成O-糖苷键作为与丝氨酸、苏氨酸、羟赖氨酸和羟脯氨酸羟基的连接点，比N-糖基化更直接、更不均匀。

O-GlcNA酰化，也称为黏蛋白型O-糖基化，是最常见的类型。不太常见的类型包括O-岩藻糖基化、O-葡糖基化和O-甘露糖基化。许多蛋白质被可逆的O-糖基化修饰，如转录因子、细胞骨架蛋白、癌基因和激酶。

O-GlcNAc修饰由己糖胺生物合成途径(HBP)的终产物尿二磷酸N-乙酰葡萄糖胺(UDP-GlcNAc)实现的。O-GlcNAc转移酶(OGT)的活性介导蛋白质的O-GlcNAc酰化，去除聚糖的酶是β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(OGA)。

O-糖基化黏蛋白在一系列肿瘤细胞类型中表达，并通过调节蛋白稳定性诱导各种致癌信号分子促进肿瘤进展。

3. N-糖基化免疫检查点

图2总结了免疫细胞和肿瘤细胞表面受糖基化调控的免疫受体和配体。

3.1 B7-CD28超家族

它属于共刺激分子家族，相关通路既可以提供激动信号来增强和维持、也可以提供抑制信号来抑制T细胞免疫应答。

3.1.1 CD28和CD80/CD86

B7-CD28超家族中最早和最重要的共刺激分子是CD28和CD80/CD86。CD28是在T淋巴细胞表面发现的一种糖蛋白，与CD80 (B7-1)和CD86 (B7-2)结合。

当CD28 N-糖基化位点突变或糖苷酶抑制剂减少N-糖基化时，CD28-CD80的结合显著增加，下游信号激活被放大，表明N-糖基化负调控CD28功能。

3.1.2CTLA-4（CD152）

(细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4)，通常称CD152，是CD28的同源物，但它与CD80/CD86 (B7-1/2)结合的亲和力高于CD28。CTLA-4是一种表达在T细胞上的免疫检查点受体，与CD28竞争结合位点，导致免疫应答下调。

它受糖基化调节，N-聚糖数目和支链会影响其细胞表面水平。TCR信号通路上调CTLA-4表面表达，通过己糖胺和N-聚糖分支通路影响T细胞功能。

3.1.3PD-1/PD-L1

程序性细胞死亡蛋白-1 (PD-1)/程序性死亡配体1 (PD-L1)是已确定的主要免疫检查点之一，抑制或阻断PD-1/PD-L1通路可显著增强T细胞介导的免疫杀伤活性，从而增强抗肿瘤作用。

糖基化对PD-1和PD-L1的相互作用至关重要。PD-1核心岩藻糖基化N聚糖的N49和N74被确定为抑制焦点转移酶8 (Fut8)的关键位置，可降低PD-1表达，增强T细胞活化。PD-1在T细胞中N49、N58、N74和N116位点高度N-糖基化，特别是N58。当T细胞被激活时，PD-1的糖型如聚LacNAc和核心岩藻糖基化上调。β-1,3-N-乙酰葡糖胺基转移酶 (B3GNT3)和FUT8分别催化聚LacNAc和核心岩藻糖的合成。

糖基化还调节癌症干细胞(CSCs)中PD-L1的表达。N-糖基转移酶STT3通过β-连环蛋白被上皮-间充质转化(EMT)上调，诱导PD-L1-N -糖基化调节PD-L1在CSCs中的积累，从而促进免疫逃避。它的高表达与结肠癌患者预后不良有关。KYA1797K是结肠癌中的抑癌基因，通过抑制β-catenin/STT3信号通路抑制PD-L1 N-糖基化和结肠CSCs的免疫逃避，这为结肠癌免疫治疗开辟了新的可能性。

N-糖基化在维持蛋白质稳定性方面起关键作用。不完全糖基化的PD-1也受泛素化的调控。KLHL22是PD-1的E3连接酶衔接子，在其膜定位之前诱导不完全糖基化的PD-1降解。KLHL22下调抑制T细胞活化和抗肿瘤反应。非糖基化的PD-L1稳定性较差，可与糖原合成酶激酶3β (GSK3β)结合，磷酸化后被泛素/蛋白酶体系统降解。EGF信号诱导的PD-L1糖基化可阻碍GSK3β与PD-L1相互作用，稳定PD-L1并增强其免疫抑制活性。

EGFR小分子抑制剂吉非替尼可抑制EGF信号通路，使PD-L1不稳定，增强抗肿瘤免疫。EGF信号还通过上调B3GNT3，促进三阴性乳腺癌(TNBC)细胞中N192和N200位点的PD-L1N -糖基化，使PD-L1与细胞毒性T细胞上的PD-1相互作用，导致T细胞衰竭。

去糖基化PD-L1的表达是预测PD-1抑制剂疗效的重要生物标志物。检测PD-L1的标准临床方法是免疫组化(IHC)检查，PD-L1表达越高，PD-1抑制剂的疗效可能越好。然而部分低表达或无表达PD-L1的患者对PD-L1抑制剂也有反应，这可能与PD-L1的糖基化状态有关。虽然PD-L1高度糖基化，但临床上用于检测PD-L1的诊断抗体不能有效识别糖基化的PD-L1，导致PD-L1的IHC检查出现假阴性。用肽-N-糖苷酶F (PNGase F)去除福尔马林固定石蜡包埋中的肿瘤块，然后进行IHC，检测灵敏度显著提高。

3.1.4PD-L2和PD-1

PD-L2（CD273或B7-DC），是与PD-1结合的第二个重要配体。该结合抑制T细胞活化。PD-L2表达水平可作为预测抗PD-1治疗临床疗效的补充信息。

PD-L2在N64、N157、N163和N189位点被STAT3FUT8介导N -糖基化，并在西妥昔单抗耐药头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)中过表达。在HNSCC体内模型中，抑制PD-L2糖基化可降低表皮生长因子受体(EGFR)阻滞剂西妥昔单抗的耐药性，糖基化水平可预测抗EGFR疗效。

此外，N-糖基化通过阻断泛素化介导的溶酶体降解来维持PD-L2稳定性。

PD-1和PD-L1/2结合和与糖基化相关的降解机制如图3所示。

3.1.5ICOS/ICOSL

共刺激因子(ICOS)与ICOSL (B7-H2)结合，提供共刺激信号激活T细胞。在ICOS中存在推测性的N连接糖基化位点：N89连接的糖基化使ICOS保持稳定并将其运送到细胞表面膜；N110糖基化位点在ICOS-L结合中很关键，敲低N110位点可使其与ICOSL的结合亲和力提高4.3倍。

3.1.6B7-H3 (CD276)、B7-H4 (B7x/B7S1)、HHLA2和TMIGD2

B7-H3在多种肿瘤中表达，抑制B7-H3可以防止肿瘤的形成。B7-H3在口腔鳞状细胞癌的肿瘤细胞和APC中显著过表达，与正常口腔上皮细胞相比，肿瘤细胞表面的B7-H3高度岩藻糖基化，N-糖基化异常。研究发现：FUT8催化B7-H3 N -聚糖的核心岩藻糖基化，以维持其高表达和稳定性，从而促进免疫抑制。

同样B7-H4作为一种共抑制配体，在免疫冷肿瘤中高表达，并与PD-L1表达呈负相关。B7-H4的N-连接糖基化通过阻止B7-H4的泛素化来保持稳定性。抑制B7-H4的N-糖基化使免疫冷肿瘤转变为免疫热肿瘤，可增加对免疫治疗的反应。

3.1.7NK细胞上表达的受体

与T细胞不同，NK细胞是淋巴细胞，能在无预先致敏的情况下破坏肿瘤细胞。成熟NK细胞表达多种激活受体，其中最重要的是天然细胞毒性受体(NCRs)，包括NKp30、NKp44和NKp46。NKp30是与B7-H6结合的NK细胞的主要激活受体。它的茎结构域是配体结合所必需的，其差异糖基化影响配体结合的亲和力，从而影响下游的细胞内信号。此外，NKp30外膜有三个不同的位点(N42、N69和N121)被N糖基化，有研究报道N糖基化是NKp30寡聚的关键。

3.2B7超家族外的免疫检查点

除了CD28/B7超家族外，免疫细胞、肿瘤细胞和免疫抑制骨髓细胞表达的各种共抑制受体也可以被N-糖基化控制。

3.2.1LAG-3

淋巴细胞活化基因-3 (LAG-3)是一种在T细胞中表达的I型跨膜蛋白，具有四个结构域。其细胞外结构域与CD4相似，可与CD4竞争结合MHCII抑制T细胞活化。

多项研究表明，在多种人类肿瘤类型中，LAG-3的高水平表达与肿瘤生长和预后之间存在相关性。LAG-3高度糖基化在D2-D4结构域有多个N-糖基化位点，有报道LAG-3可与Galectin-3或肝窦内皮细胞凝集素(LSECtin)相互作用，其结合位点为LAG-3上的聚糖。然而，LAG-3糖基化是否与肿瘤免疫相关尚不清楚。

3.2.2TIGIT

具有免疫球蛋白和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)是T细胞和NK细胞上表达的另一种重要的免疫抑制受体，包含三个配体，其中在肿瘤细胞和APC中表达的PVR (CD155)是TIGIT的主要配体，具有较高亲和力。TIGIT最终通过与PVR结合以及随后的一系列反应抑制抗肿瘤免疫。

研究发现两个N-糖基化位点N32和N101，其中N101对PVR和TIGIT相互作用的影响更显著。TIGIT的N -糖基化在维持TIGIT和PVR之间的相互作用是必要的，这可能是免疫治疗的潜在靶点。

3.2.34-1BB (CD137/TNFRSF9)

这是一种可诱导的肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员，在免疫系统的各种细胞尤其是T细胞中表达。晶体结构显示4-1BB与其配体4-1BBL/CD137L/TNFSF9通过富半胱氨酸结构域(CRD) 2和3相互作用，促进免疫细胞的激活和增殖。

研究发现，4-1BB的胞外结构域在CRD4上有两个糖基化位点(N138和N149)，证实N-糖基化与4-1BB/4-1BBL结合无关。此外，N-糖基化通过维持其寡聚性来促进4-1BB膜的定位。

3.2.4TIM-3/Gal-9

T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域-3 (TIM-3)是一种活化诱导的抑制性受体，并与其配体半乳糖凝集素-9 (Gal-9)结合，在癌症中诱导免疫耐受和T细胞衰竭。同时，PD-1和TIM-3在T细胞上的共表达与癌症中的T细胞衰竭有关。

报道称Gal-9与TIM-3上的碳水化合物链结合，经重组糖苷酶(PNGase F)处理的TIM-3不能与Gal-9结合，提示糖基化调控了两者的结合。此外，共表达PD-1与TIM-3偶联形成异二聚体，Gal-9交联这些二聚体形成凝集素/糖蛋白晶格，从而阻断TIM-3/Gal-9诱导的T细胞死亡。

3.2.5Siglec-15

唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素(Siglec)家族作为一种抑制性受体，通过识别唾液酸聚糖来塑造免疫抑制性肿瘤微环境。Siglec-15不同于其他Siglec家族成员，与B7- H1等B7家族成员有30%以上的同源性，但其表达与B7- H1无关。Siglec-15在人类癌细胞和肿瘤相关巨噬细胞/髓系细胞中上调，在N172位点上被N连接糖基化，从而减少其溶酶体依赖性降解，促进其细胞膜定位。

3.2.6“别吃我”信号蛋白CD47、CD24

肿瘤细胞可在细胞膜上表达CD47、CD24等“别吃我”信号蛋白，以避免巨噬细胞的吞噬，实现免疫逃逸。

CD47又称整合素相关蛋白(IAP)或抗原表面决定蛋白OA3，是一种广泛表达于肿瘤细胞的具有免疫球蛋白样结构的糖蛋白，与巨噬细胞表面的信号调节蛋白α (SIRPα)结合，产生一系列抑制巨噬细胞吞噬作用的级联反应。研究发现CD47上有6个可能的N-糖基化位点，去除这些位点会改变CD47的表达，然而N-糖基化是否影响CD47/ SIRPα结合和肿瘤免疫逃避仍不清楚。

CD24与CD47相似，在肿瘤细胞表面高度糖基化，与TAMs上高表达的抑制受体Siglec-10作用，从而抑制巨噬细胞的吞噬作用。有研究建立了Siglec-10/唾液聚糖复合物的3D模型，发现Siglec-10倾向于将底物上的唾液化复合物型N-聚糖结合。

3.2.7NK细胞上表达的受体

NK细胞的另一种激活受体是自然杀伤基团2D (NKG2D)，是表达在NK细胞表面的同型二聚体。由于细胞应激和DNA损伤，MHC类I多肽相关序列A (MICA)和MHC类I多肽相关序列B (MICB)在肿瘤细胞表面表达，可与NKG2D结合诱导免疫应答。肿瘤通过MICA蛋白的蛋白水解脱落来逃避免疫监视。对于细胞膜表面表达，由某些MICA等位基因表达的胞外结构域蛋白的N-糖基化至关重要。

2B4 (CD244)是信号通路淋巴细胞活化分子相关受体家族中的一种细胞表面糖蛋白，在所有NK细胞、CD8+ T细胞和树突状细胞上均有表达，参与NK细胞和T细胞功能的调节。CD48作为2B4的配体在造血细胞表面表达，两者的结合对于细胞-细胞相互作用至关重要。

2B4经N-和O -糖基化修饰高度唾液酸化，用糖苷酶去除N-聚糖会显著抑制2B4与CD48的结合。从NK细胞表面去除唾液酸或抑制O-连接糖基化可增加2B4/CD48结合，从而促进NK细胞活化。

4.O-糖基化免疫检查点

O-糖基化促进肿瘤生长和发展。TIM-3是粘蛋白型O-糖基化，是Gal-9结合所必需的，但其是否在肿瘤的诊断和治疗中起作用尚不清楚。丝氨酸和苏氨酸是糖基化过程中不可缺少的两个环节。通过O-糖基化对富含丝氨酸/精氨酸的蛋白激酶2 (SRPK2)进行翻译后修饰，可促进乳腺癌细胞在体外和体内的生长。

此外，已证实O-糖基化磷酸甘油酸激酶1 (PGK1)增强糖酵解途径。糖基化修饰通过诱导PGK1的线粒体易位抑制线粒体内三羧酸(TCA)循环，从而促进结肠癌的增殖和生长。

5.糖基化-RNA

最近研究表明RNA可能被用作蛋白质或脂质之外的第三个糖基化靶点。新发现的可被糖基化的RNA是一种小的、保守的非编码RNA，称为“GlycoRNA”，通常位于细胞质中，包括snRNA、snoRNA、miRNA、siRNA、piRNA、stRNA等。

GlycoRNA以富含唾液酸和岩藻糖的N-聚糖为特征，其化学合成的具体途径尚不清楚，但很可能与蛋白质N-糖基化的方式大致相同，甚至需要一些相同的酶。它出现在胞外膜上，提示可能在信号转导中发挥作用。由于唾液酸含量丰富，GlycoRNA与两种唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素(Siglecs)结合，被认为是Siglec家族的潜在配体。

GlycoRNA已在各种人类细胞系中被检测到，并且这些特定细胞上的RNA已被发现与各种自身免疫性疾病相关的小RNA相同，因此其有可能与免疫系统相关。

6.糖基化靶向免疫治疗的应用

近年来，免疫疗法取得了巨大的进展。针对PD-1/PD-L1的免疫检查点抑制抗体，包括帕博利珠单抗、纳武利尤单抗和阿替利珠单抗，尽管总体缓解率仍不高，但已显示出显著的临床获益。

大多数免疫检查点分子可以通过糖基化修饰。因此，免疫检查点分子的糖基化已成为肿瘤免疫治疗的一个有前途的靶点。针对糖基化的新药已经开发，正在进行体内外试验，一些药物已经开始临床试验。表1是针对糖基化的新药物。

总结：

没有共同核心结构的O-糖基化比N-糖基化更复杂，故现有研究大多着眼于N -糖蛋白。此外发现RNA可以通过糖基化修饰，使得RNA成为除蛋白质和脂类外的第三个糖基化支架。

探索糖基化的分子机制将加深对肿瘤免疫的认识，深入研究免疫检查点分子的糖基化可能为肿瘤免疫治疗的临床应用提供更好的策略。