hello，又是周一，新的开始，今天我们继续分享10X空间转录组的分析内容，而今天主要的内容就是借助空间技术解析肠道的损伤和修复动态，其中用到了大家熟知的NMF降维分析手段，参考文献在The spatial transcriptomic landscape of the healing intestine following damage，纯粹使用空间转录组分析的文章，非常有借鉴意义。
值得注意的分析点
- NNMF无监督区分空间区域
- 预测算法揭示了取决于位置的协调信号通路
- 空间定位问题
- 空间细胞类型共定位分析
- 因子化正常和疾病样本以识别疾病对样本的影响、组织自愈的过程发展。
Abstract
肠道屏障由一个复杂的细胞网络(细胞网络是空间转录组独有的个性化分析，大家可以参考我之前的分享10X空间转录组数据分析之同型分数（细胞网络）和异型分数（临近网络）计算)组成，它定义了高度分隔和专门的结构。在这里，使用空间转录组学 (ST) 来定义转录组landscope在稳态和愈合小鼠结肠中的空间组织方式。在稳态条件下，展示了以前未被重视的结肠分子区域化，这在粘膜愈合过程中发生了显着变化。在这里，分析确定了空间组织的转录程序，这些程序定义了分隔的粘膜愈合，以及具有主要wired pathways的区域。此外，发现 p53 激活减少定义了增殖上皮干细胞存在增加的区域。最后，利用分析数据绘制了与人类疾病相关的转录组学模块，证明 ST 可用于为临床实践提供信息。总的来说，我们提供了一个公开可用的资源，定义了粘膜愈合过程中结肠转录组学区域化的原则，以及一个发展和推进进一步假设的框架。
Introduction
肠道分为小肠和大肠，它们共同拥有最高密度的共生微生物群（肠道微生物的研究也是医学研究的重点之一），而这些微生物群又在近-远轴上具有空间异质性。 geographically异质的微生物暴露有助于建立高度分隔的器官，该器官根据近端-远端位置具有不同的功能。 例如，与远端小肠相比，近端小肠中的维生素 A 代谢酶以及视黄酸的产生和功能更高，从而产生从近端到远端的梯度。 尽管人们普遍认为小肠高度分隔，但结肠中是否存在明确的分子区域化尚待确定。
肠道依靠肠上皮的不断再生来维持体内平衡。 再生途径的中断可能导致病原体易位和慢性肠道病变的发展，例如炎症性肠病 (IBD)。因此，肠道屏障必须迅速适应以促进组织再生和损伤后的愈合。 然而，稳态条件下的细胞和molecular circuitry以及它如何适应挑战尚待充分表征。
肠道提供了一个独特的机会来研究屏障组织修复的共同原则，因为它的空间组织是其功能的基础。当发生肠屏障损伤时，受损的上皮细胞脱落并被动员的肠干细胞 (ISC) 衍生细胞取代，这种现象高度依赖于来自邻近微环境（niche）的信号。类似地，免疫细胞被原位募集或扩增以保护宿主免受病原体入侵并通过提供解析信号来协调愈合过程。Although initially considered as a mere structural support, stromal cells, which includes fibroblasts, endothelial/lymphatic cells, pericytes and glial cells, are also actively involved in barrier healing through tissue remodeling, matrix deposition, neoangiogenesis, muscle contraction, and production of pro-regenerative signals。因此，免疫细胞、上皮细胞和基质细胞必须在确定的微环境中快速适应并建立分子网络以促进组织修复。然而，肠道的不同部分及其微环境是否具有不同类型的组织修复机制目前尚不清楚。（是不是空间转录组也可以用于肠道微生物的研究，这个值得期待）
之前的研究揭示了在葡聚糖硫酸钠 (DSS) 结肠炎过程中结肠组织的时间转录组学动态，确定了在急性损伤或再生过程中差异调节的基因和途径。尽管bulk或单细胞 RNA 测序研究提供了无偏见的转录组分析， 组织内的空间环境通常会丢失。 相比之下，空间基因表达分析的靶向技术（例如原位 RNA 测序、荧光原位杂交 [FISH]、RNA 范围）需要特定候选基因的知识来query，thus do not allow an unsupervised investigation of pathways enriched in healing areas。
为了克服这些限制，利用了空间转录组学 (ST)，这是一种无偏技术，可以对组织切片中的多聚腺苷酸转录本进行测序，该技术可以在空间上映射到组织学明场图像上。 ST 能够揭示小鼠结肠分子区域化的前所未有的特征，这在人类肠道标本中得到了进一步验证。通过比较稳态和粘膜愈合（即来自 DSS 治疗的小鼠）结肠组织的 ST，确定并在空间上绘制了组织修复过程、免疫细胞激活/募集、促再生途径和组织重塑的转录特征。粘膜愈合过程中通路活动的空间landscope也揭示了 p53 活性与增殖的上皮干细胞之间的负相关。此外，与人类 IBD 患者疾病结果相关的基因的靶向定位和从全基因组关联研究 (GWAS) 中确定的 IBD 风险变异能够根据它们在具有不同组织学特性的区域中的定位来推断它们参与特定的病理过程。
Results
Spatial transcriptomics revealed distinct molecular regionalization of murine colonic epithelium at steady state condition（空间转录组学揭示了稳态条件下小鼠结肠上皮的不同分子区域化）
为了表征稳态条件下结肠组织的转录组学特征，使用 Visium (10X Genomics) 平台处理冷冻结肠以进行 ST。 预过滤的数据集主要对应于蛋白质编码基因。 过滤掉非编码 RNA (ncRNA) 和线粒体蛋白编码基因后，所得数据集由 2604 个单独的spot组成，每个点平均有 ~4125 个基因和 ~11801 个独特的转录本。 首先，使用非负矩阵分解 (NNMF) 对空间转录组数据集进行去卷积以推断activity maps，并且将分析限制为仅 3 个能够在稳态条件 (d0) 下捕获结肠最基本结构的因素。分析确定了 3 个基本的结构转录组学landscope，它们在组织学上是可辨别的，分别是肠上皮细胞 (IEC) (NNMF_3)、肌肉 (NNMF_2) 以及固有层 (LP) 和 107 nd IEC (NNMF_1) 之间的混合物，它们与 IEC 没有区别朝向最远端的结肠。 对每个factors的主要贡献基因的分析证实了肌肉和 IEC 的身份，以及 IEC、肌肉和 LP 之间的混合特征。 使用来自人类蛋白质图谱的免疫组织化学 (IHC) 数据，分别验证了 CDH17（也称为肝肠钙粘蛋白或 LI 钙粘蛋白）和 TAGLN（转凝胶蛋白，平滑肌标记物）在 IEC 和肌层中的特异性表达。 相比之下，ADH1（酒精脱氢酶 1）在 LP 和 IEC 隔室之间表现出混合表达。为了更好地可视化跨越近端-远端和浆膜-腔轴的分子区域化，按照方法中的描述以digitally unrolled结肠（这个地方后面会详细介绍）。肌肉、LP/IEC和近端IEC factors在digitally unrolled的结肠的远端-近端和浆膜-腔轴的相应区域富集。在基因驱动因子3（ NNMF_3) 我们发现 Car1、Mettl7b、Emp1、Fabp2 和 Hmgcs2 在近端结肠中高度表达。我们的数据与显示 Car1 启动子在近端而非远端结肠中驱动表达的报告一致. 相比之下，Retnlb、Sprr2a2 和 Ang4 在中结肠富含，而 Prdx6、Tgm3、Ly6g、Eno3 和 B4galt1 在远端富集。因为它们之前没有被描述为不同结肠区室的标记，使用 qPCR 来验证编码生酮限速酶、线粒体 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶 A 合成酶 2 (HMGCS2) 的基因的区域特异性 mRNA 表达)、抗菌肽血管生成素 4 (ANG4) 和 Beta-1,4-半乳糖基转移酶 1 (B4GALT1)。因此，ST 分析区分了 LP、IEC 和肌肉隔室之间的分层，这在近端结肠而非远端结肠处非常明显。 一些研究表明近端和远端结肠在结构和功能上存在差异，特别是在上皮方面；然而，缺乏系统和无监督的结肠分子区域化。为了客观地识别在结肠特定隔室中差异表达的基因，使用 NNMF 方法来区分数据可变性的相关来源。原始结肠的详细因子分析（用“n”表示）导致更明显/明显的结肠区室化，其中定义因子的顶级基因足以明确划分结肠中的区域化。特别是，这些因素定义了近端-远端和浆膜腔轴。使用定义近端和远端结肠 IEC 的因素的主要贡献基因的功能富集分析表明，鼠类近端结肠专门从事吸水，而远端结肠专门从事溶质运输，表明近端和远端 IEC 隔室之间的功能差异。总而言之，ST 允许在稳态结肠中鉴定先前未被重视的结肠分子区室化水平。
Visualization of lymphoid structures by factors enriched with B-cell associated genes（通过富含 B 细胞相关基因的因子可视化淋巴结构）
接下来，我们检查了数据集解析组织内宏观结构（例如淋巴cluster）的能力。 观察到因子 1n、3n 和 9n 中 B 细胞相关基因的富集。 将这些因子映射到结肠组织后，观察到因子 1n 和 3n 定义了类似于淋巴聚集体的结构，称为孤立的淋巴滤泡 (ILF) 和/或隐斑 (CP)。 相比之下，因子 9n 定义了结肠 LP，其特征是基因的高表达，例如 Igha、Jchain、Igkc 等浆细胞特征。 在 factor_3n 中发现的顶级基因中，验证了淋巴滤泡中的 Clu 蛋白表达。类似地，JCHAIN 是一种由浆细胞产生的 15 kDa 小糖蛋白，可调节分泌性 IgA 和 IgM 的多聚化并促进它们跨粘膜上皮的转运，它的表达通过人结肠 LP 中的 IHC 进行了验证。通路分析证实这些因素与免疫反应有关。与因子 3n 相关的通路提示淋巴细胞启动位点（由与淋巴细胞激活相关的过程定义），而与因子 9n 相关的通路提示效应免疫反应位点（由与适应性免疫相关的过程定义）。有趣的是，factor_1n 定义了覆盖 ILF 的细胞/区域，其特征在于已知募集 CCR6+ B 细胞的 Ccl20 和 Il22ra2/Il22bp 等基因，后者是一种可溶性受体，可中和 IL-22 的作用，IL-22 是一种多效性细胞因子，主要由淋巴组织诱导细胞(LTis)。此外，factor_1n 与参与细胞动员和对外部刺激的反应的通路有关。由于观察到因子 1n 定义了 ILF，因此很容易提出因子 1n 定义的结构可以作为进一步成熟为 ILF（因子_3n）的anlagen。
Factor analysis identified molecular signatures that define areas associated with the enteric nervous system（因子分析确定了定义与肠神经系统相关区域的分子特征）
因子 6n 的特征在于富含位于肌肉区域的肠神经系统 (ENS) 相关基因。 在排名靠前的基因中，我们验证了泛素 C 端水解酶 L1 (UCHL1)，它在神经元中特异性表达。 功能富集分析证实，factor_6n 定义了与 ENS 相关的转录组谱。 总之，Visium 数据集的分辨率允许识别已知结构，从而提供一个平台来进一步研究这些区域内的特定molecular circuitry。
Molecular landscape of intestinal mucosal healing
接下来，我们试图在粘膜愈合过程中在空间上解析结肠转录组landscope。 分析表明，到 14(d) 天，在葡聚糖硫酸钠 (DSS) 引起的损伤后，肠道屏障完整性得以恢复。 因此，在饮用水中用 DSS 处理野生型 (WT) 小鼠 7 天，然后恢复 7 天，并取出第 14 天结肠组织以生成frozen Swiss-rolls以用于 ST。 尽管在生理水平上恢复（即体重增加），DSS 治疗后的结肠组织并没有完全恢复稳态，正如其长度减少所证明的那样(a sign of inflammation)。
在组织学水平上，很容易识别出大的淋巴斑块以及穿过肠道的肌肉和粘膜层。 由不知情的病理学家注释的苏木精和伊红 (H&E) 切片揭示了组织的异质性，包括分离的淋巴滤泡 (ILF) 的存在，以及具有水肿、增生、隐窝重复和正常组织的区域。 值得注意的是，远端结肠（Swiss roll)的中心）显示出明显的改变，而近端结肠（外Swiss roll)）似乎没有受到影响 。
d14 ST 数据集由 3630 个单独的spot组成，每个点都有许多独特的基因 (nFeature_RNA)，与 d0 组织切片相当。 为了首先了解粘膜愈合过程如何在空间上改变结肠转录组，使用统一流形近似和投影 (UMAP) 将来自 d0 和 d14 的 ST 数据嵌入到 3 维中。 然后将这 3 个维度的值重新缩放为一个单位立方体（范围为 0 到 1），并用作 CMYK 颜色空间中的通道，为每个 ST spot生成特定颜色。 有趣的是，d0 和 d14 样本之间的淋巴滤泡（通过 H&E 染色识别）和近端结肠区域显示出高度相似性（即相同颜色），表明这些结构在随后的粘膜愈合过程中受到的转录影响较小 肠道损伤。 反之亦然，与组织病理学评分一致，d14 结肠的远端部分是受影响最严重的区域。
为了可视化结肠组织如何在不同区域转录组织，我们使用harmony整合了来自 d0 和 d14 的数据并进行了聚类分析（这是空间数据进行的harmony分析）。分析注释了 17 个不同的cluster，这些cluster通过使用 UMAP 在二维中嵌入数据来进行可视化。每个cluster差异上调的基因总结在一个热图中，显示了每个cluster中最保守的基因。每个cluster定义了组织的不同空间区域。例如，cluster 12 指定为 ENS，在粘膜下层具有分散的表达，而cluster 0 在空间上映射到近端结肠。有趣的是，在粘膜愈合期间（第 14 天），定义cluster 0 的基因向中结肠扩展。在这些基因中，Muc2 和 Reg3b 表现出向中结肠的扩展表达，在建立屏障完整性方面起着关键作用。使用 qPCR，验证了在粘膜愈合过程中 Reg3b 的扩展表达。总体而言，聚类分析表明，尽管存在保守的转录结肠区域化，但组织愈合过程是不同分子特征出现的基础，并改变了特定基因表达的分布。
Non-negative matrix factorization analysis revealed a previously unappreciated transcriptomic regionalization during mucosal healing（非负矩阵分解分析揭示了粘膜愈合过程中以前未被重视的转录组学区域化 ）
尽管大部分组织是由在两个时间点上同样代表的cluster定义的，但一些cluster在组织愈合过程中显示出部分或剧烈的富集。在第 14 天，第 3 组（位于 LP 和肌层界面的远端结肠中）、第 11 和 16 组（位于第 14 天远端结肠的受损区域）和第 13 组（标记淋巴滤泡）显著富集。为了可视化粘膜愈合过程如何改变结肠的转录组landscope，使用 NNMF 将 d0 和 d14 数据集联合反卷积为 20 个因素。其中，8 个因子由在粘膜愈合期间（第 14 天）的特定区域表达的基因定义，但不是在第 0 天。在近端结肠中，因子 1 的特征在于参与胆汁酸和脂肪酸代谢的基因（例如 Cyp2c55，一种参与 19-羟基二十碳四烯酸代谢的酶）。相比之下，位于远端结肠的因子以参与炎症过程（例如 Duoxa2 和 Il18）和组织重塑（例如 Col1a1 和 Col1a2）等的基因为特征。由于它们在粘膜愈合过程中非常接近且显著富集，重点关注因子 5、7、14 和 20。因子 5 描绘了一个水肿区域，其组织学特征为炎症，位于严重受损的上皮层下方，具有完整的加密体系结构的丢失（i.e.因子 14）。通路分析显示因子 5 与涉及解剖结构发育、细胞粘附和细胞外基质 (ECM) 组织的过程相关。在定义该因素的顶级基因中，发现了 Igfbp5 和 Igfbp4，以及胶原蛋白 Col1a1 和 Col1a2。相比之下，因子 14 的特征在于参与应激反应（例如 Duoxa2 和 Aldh1a3）和白细胞浸润（例如 Ly6a ansd Cxcl5）的基因表达，这表明对屏障破坏和组织损伤的急性反应。
在结肠组织的末端，肛门将带有单层上皮（直肠）的粘膜组织与分层的鳞状上皮（皮肤）分开。 由结肠炎症引起的稳态破坏会产生一个上皮不稳定区域，其中皮肤和结肠上皮之间的界面出现异质组织（即扩大的多层隐窝状结构，具有鳞状但未角化的外观）。 因子 7 以几种角蛋白（例如 Krt13、Krt5、Krt14 和 Krt6a）的表达和涉及角化细胞分化和伤口愈合的途径为特征，描绘了该区域。
最后，因子 20 主要定义了发生增生和隐窝分枝的远端上皮，这表明上皮修复。 基因本体论表明，该因子与器官发生（例如 Hoxb13）和对有机底物（例如 Cyp2c68）的反应有关。 总体而言，DSS 诱导的损伤导致小鼠结肠内不同组织病理学过程的各种共同发生。 此外，分析揭示了以前未被重视的组织修复的异质转录和区域landscope。
Predictive algorithms revealed coordinated signaling pathways depending on location（预测算法揭示了取决于位置的协调信号通路）
通过使用 PROGENy query是否可以通过空间组织的转录谱推断不同的信号通路。与其他基因集富集工具（如 KEGG）不同，PROGENy 通过查看信号通路中下游基因的表达变化来估计信号通路活性，从而提供对通路活性的更准确估计（也就是进行更好的富集分析）。在 PROGENy 中注释的 14 条通路（即 Wnt、VEGF、Trail、TNFa、TGFb、PI3K、p53、NFkB、MAPK、JAK/STAT、Hypoxia、雌激素、雄激素和 EGFR）中的每条通路的评分被估计为每个 ST 点d0 和 d14 slides。首先，计算了一个相关矩阵，以了解 NNMF 识别的空间组织转录程序如何可以通过信号通路活动来解释。分析观察到两个主要组，其中，第 2 组通路（雄激素、JAK-STAT、NFkB、TNFa、p53、缺氧和 Trail）是对损伤的炎症/急性反应的特征，与包括受损远端上皮的因素有关（例如因子 7、10、14、20）和近端上皮（因子 11、19）。相比之下，第 1 组通路（TGFb、Wnt、PI3K、雌激素和 EGFR）通常调节促再生/组织重塑过程，与定义受损上皮下方组织的因素（例如因子 5 和 17）、肌肉层相关（因子 2、6 和 12）和淋巴滤泡（因子 9）。此外，MAPK 和 VEGF 通路与相似的因素相关，正如预期的那样，MAPK 和 VEGF 通路活性的空间模式具有可比性。值得注意的是，在稳态条件 (d0) 下，MAPK 和 VEGF 通路沿中远侧结肠均匀活跃，而在粘膜愈合期间，它们在受损/再生区域内的激活更高。
Shared and complementary pathway activities during mucosal healing
某些因子（例如因子 10 和 14）之间可比较的 TNFa、NFkB 和 JAK-STAT 通路激活评分表明这些炎症通路之间存在相互关联。 为了测试这种可能性，进一步分析了这些途径的空间格局。 特别是，无论分析的时间点如何，结肠内 TNFa 和 NFkB 通路的活性几乎相同。 在与损伤和 ILF 相关的区域中，较高的 TNFa 和 NFkB 活性appreciated。 值得注意的是，在没有损伤/炎症 (d0) 的情况下，TNFa 和 NFkB 的空间分布显示活动仅限于 ILF 管腔边缘 (d0)，这与之前表明 TNF 驱动 ILF 器官发生的研究一致。ILF 是否在何处形成 亚临床局部损伤是否发生，或者它们的存在是否允许与外部环境的动态交换，导致亚临床炎症，仍有待探索。
相比之下，JAK-STAT 通路激活显示与 TNF 和 NFkB 共同发生，主要发生在受损区域（因子 14），但不在 ILF 中。 这些结果表明，虽然所有三种途径都可能在受损组织中发挥作用，但 TNFa 和 NFkB，而不是 JAK-STAT，参与了 ILF 的形成/功能。 与这些途径不同，雄激素和雌激素途径显示出相互排斥的活动模式。 在受伤的上皮区域观察到较高的雄激素途径活性，而较高的雌激素活性与肌肉层相关，表明这些途径在粘膜愈合过程中相互负向调节。
Low p53 pathway activity is associated with proliferating crypts
p53 通路的激活在近端 - 远端轴上均匀分布，但与 LP 和肌肉层相比，它在管腔侧显示出更多的活性。有趣的是，p53 活性在受损区域较低。 p53 的激活触发细胞周期停滞、衰老和细胞凋亡 31，这表明 p53 活性降低的斑点可能在受损区域内的增殖细胞中富集。为了测试这种可能性，在 H&E 图像上过度添加了较低的 p53 活性spot，并显示出与隐窝底部的共定位。为了研究增殖干细胞特征是否与低 p53 活性点共定位，利用了来自 d14 结肠的肠上皮细胞的单细胞 RNA 测序 (scRNAseq) 数据集，并确定了增殖干细胞群。我们将干细胞核心特征映射到 d14 结肠 ST 数据集，并将干细胞核心中得分高的点叠加到 H&E 部分。与我们的假设一致，含有高分的斑点与低 p53 活性一致。 Pearson 相关分析证实，具有高干细胞评分的 ST 点与 p53 活性呈负相关。因此，分析的数据表明低 p53 活性允许在粘膜愈合过程中识别增殖的隐窝。总之，我们在空间上定位了 PROGENy 预测的临床相关通路，并表明这些通路在粘膜愈合过程中高度协调。
Integration of human datasets with mouse spatial transcriptomic（这个有点意思，跨物种的单细胞空间联合分析）
为了探究小鼠结肠 ST 的转化潜力，分析调查了人类数据集是否可以整合到小鼠 ST 数据中。为此，利用人类发育中的肠道数据集，将 31 个不同的上皮细胞和基质细胞映射到我们的 ST 数据集上。观察到人类细胞类型和不同的鼠 ST 因子之间的相关性，表明人类细胞特征在小鼠结肠内的特定定位。有趣的是，人类近端肠细胞的特征与因子 1 高度相关，因子 1 定义了小鼠的最近端上皮。人类远端肠上皮细胞和吸收细胞与因子 3 和 10 高度相关，这些因子定义了小鼠最远端的上皮。这些结果表明，定义近端和远端上皮细胞的转录组学特征在小鼠和人类之间是保守的。另一方面，以趋化因子 CCL21 和 CXCL13 表达为特征的两种人类基质细胞与因子 9 独特且强烈相关，定义淋巴滤泡，这与这些趋化因子在 ILF 发育中的众所周知的作用一致 。有趣的是，这些基质细胞在小鼠 ILF 中以互补模式映射，表明这些细胞的协同作用可能决定了毛囊内免疫细胞的募集/定位。 接下来，分析了与 S1（基质 1，成纤维细胞标记人体粘膜下结构细胞的大部分）、S1-COL6A5 和 S1-IFIT3 人类细胞（S1 的两个亚型）相关的损伤/再生区域（因子 5 和 14）和映射为互补的分布模式。
然后，将分析扩展到粘膜愈合期间的其他细胞类型。有趣的是，在粘膜愈合期间，免疫细胞、间皮、内皮和成纤维细胞特征在特定区域内在空间上富集。特别是，成纤维细胞在因子 5（重塑）中占主导地位，而在因子 9（淋巴滤泡）中的免疫细胞中占主导地位，而内皮细胞和间皮细胞在因子 7（角化）中共定位。在 10 种不同的免疫细胞类型中，有 32 种，单核细胞和 SPP1+ 巨噬细胞分别富含因子 14（危险反应）和因子 5（组织重塑），这与它们在对损伤和基质沉积/伤口愈合的急性反应中的已知作用一致。相反，淋巴细胞和树突状细胞富含因子 9（淋巴滤泡）。进一步的分析显示了这些免疫细胞如何在 ILF 内异质分布。These results provide a proof-of-concept and support the notion that principles of spatial distribution within the colonic tissue appear to be conserved between species and highlight murine ST as a valuable platform for exploring and translating findings on distribution patterns of cells/genes within a tissue。
Mapping transcriptomic datasets onto ST to inform medical practice
为了建立一个框架，将现有知识与 ST 数据集相结合，我们利用了在 DSS 诱导的结肠炎模型 10 中急性上皮损伤和恢复阶段收集的结肠组织的纵向 RNAseq 数据集。在这项研究中，我们确定了显示特征表达模式的基因sets（称为模块），其中一些基因是：a）在损伤时下调（模块 2、8、7），b）在急性/炎症期上调（模块 1， 3、4、9) 和 c) 在 DSS 结肠炎的恢复阶段上调（模块 5、6）。 为了确定不同的时间调节过程（即模块）是否在组织的特定区域富集，我们计算了模块的基因特征与 ST 因子之间的相关矩阵。 在模块 (m)1 和 m6 中发现了更高的基因富集，分别以在炎症和恢复阶段诱导的基因为特征。在因子 9 和 m1 之间共享的基因中，Ptprc、Cd72 和 Lyz2 编码免疫细胞表达的蛋白质，并主要定位于 d14 中的淋巴滤泡和受损区域（图 7Bi）。 相比之下，约 60% 的顶级驱动基因定义因子 15（即 ENS）与 m6 共享，它们的表达分布在神经元体所在的粘膜下层/肌层中。 m1 和 m2 的 GO 富集分析也证实最主要的通路与炎症反应和化学突触传递有关。 分别持续的炎症和再生特征。 因此，纵向和 ST 数据的整合可以成为揭示与疾病相关的时间和空间生物过程的有力工具。
Spatial distribution of genes defining UC1 and UC2 profiles
然后，试图调查是否可以将临床相关的患者基因特征映射到小鼠 ST 数据集上。为此，我们使用了最近识别溃疡性结肠炎 (UC) 患者亚组的基因特征：UC1 和 UC2。这种分子分类具有临床相关性，因为 UC1 相关转录组特征与对生物治疗的不良反应相关，并且富含基因参与中性粒细胞活动。相比之下，大约 70% 的 UC2 患者对抗 TNF 抗体产生了临床反应。此外，Smillie 等人，34 表明炎性成纤维细胞和单核细胞主要驱动抗 TNF 抗性，UC1 患者结肠组织中上调的许多基因被这些细胞类型高度表达。为了进一步了解 UC1 和 UC2 患者之间差异表达基因的空间分布，我们将 UC1 和 UC2 患者中上调的所有基因映射到结肠 ST。虽然定义 UC2 患者的基因在结肠中均匀表达（第 0 天和第 14 天），但定义 UC1 的基因主要位于第 14 天的损伤/修复区域内。进一步研究表明，UC1 患者的所有主要功能类别均上调，包括胶原合成（Col12a1、Col4a1、Col4a2、Col7a1）、ECM 分解（Mmp3）、Wnt 信号通路（Wnt5a）、细胞因子信号（Il11、Il1b、Il33、 Il1r2、Il1rn、Tnfrsf11b、Csf2rb、Csf3r、Socs3、Trem1、Cxcr2）和先天免疫（S100a9、S100a8、C5ar1、Sell、S100a4）也在组织损伤区域上调。总之，这些结果表明，与 UC2 患者相比，UC1 患者可能具有更高的组织损伤和溃疡。
Defining the topography of IBD risk genes
经历损伤/修复的结肠的空间转录组学提供了全面定位 IBD 相关风险基因的机会。因此，我们在 d0 和 d14 结肠组织的 ST 谱上询问了各种人类 IBD 风险基因的表达模式。在 122 个被query的基因中，95 个 IBD 风险基因是根据它们的小鼠直系同源基因的存在和它们在 ST 数据集中可检测的表达而被选择出来的。为了确定这些变体的空间表达是否定义了组织内的地形模式，我们计算了一个相关矩阵。聚类分析产生了三个主要的共表达聚类，聚类 3 具有基因之间最高的空间表达相关性。该cluster内基因的功能注释揭示了与免疫细胞募集（例如 Itgal、Icam1、Itga4）、激活（例如 Cd6、Plcg2、Ncf4、Il10ra）和抗原呈递（例如 Tap1、Tap2、Psmb8）相关的通路的富集。为了了解属于第 3 类的基因的空间分布，我们使用 ModuleScore 将它们映射到结肠组织，这是一种 Seurat 函数，可将 ST 数据集中的分数分配给一组预定义的基因（即第 3 类基因）。与cluster 3 基因的功能注释一致，在 d0 和 d14 观察到淋巴滤泡区域的富集。为了了解哪些 ST 因子富含 IBD 风险基因，我们进行了基因集富集分析 (GSEA) 并计算了 NNMF 数据集中 IBD 风险变异的过度表达分数。该分析表明，定义组织内淋巴滤泡的因子 9 是唯一显着富集 IBD 风险基因的因子。总而言之，该分析揭示了人类 IBD 风险基因子集的表达在空间上同时发生在小鼠结肠内。它们的特定表达模式表明，在为表现出异常免疫激活的 IBD 患者制定治疗策略时，结肠组织淋巴滤泡可能定义了潜在的目标区域。
Discussion
作者和其他人已经深入描述了结肠和小肠粘膜愈合过程中的转录组学特征。 然而，这些研究缺乏描述基因表达位置的空间分辨率。 在这里，在空间上放置了可能在驱动组织对损伤的反应中起关键作用的细胞群和通路。 目前的研究揭示了在稳态条件下存在的空间转录组模式，这些模式是对损伤做出的反应； 这些空间转录组模式以独特的转录特征为特征，并与不同的组织学过程相吻合。 此外，分析了不同生物过程的区域分布，例如对损伤的急性反应或再生反应。 最后，我们通过人类组织和转录组学数据中基因特征的保守空间定位以及测试临床相关基因的分布证明了该数据集的临床相关性。
最近的一项研究描述了人类肠道发育过程中的转录组学景观。在这里，我们通过利用符合制造商提供的 6.5 mm2 面积限制的鼠结肠瑞士卷来进一步研究这些结果，以执行空间转录组学。这种方法使我们能够在同一张幻灯片中可视化整个结肠的转录组景观，包括最近端和远端部分。结合生物信息学工具（NNFM 分析），我们发现了稳态条件下结肠组织的先前未被重视的分子区域化。该分析允许根据其近端至远端结肠定位来识别不同的上皮、LP 和肌层/黏膜下层遗传程序。重要的是，当将人类细胞映射到我们的 ST 数据集时，我们观察到定义近端和远端位置的转录组特征的保守性，这表明我们新描述的分子分割在哺乳动物中是保守的。
使用整个小鼠结肠，我们提供了对以前未被重视的组织修复过程划分的详细分析。与之前的报告一致，我们对粘膜愈合过程中转录组景观的公正分析表明，虽然远端结肠发生了显着的转录组变化，但近端结肠几乎与稳定状态相当。可以提出两种可能的情况：a) 损伤程度是同质的，与远端结肠相比，近端结肠愈合得更快；或 b) 与远端结肠相比，近端结肠受到更多保护。远端而非近端结肠的显着变化与在 UC 患者中观察到的表型一致，其中炎症的焦点从直肠向近端延伸。此外，发现基因和/或通路，如 JAK-STAT 和 TNFa 通路或表征 UC1 患者的基因/通路，在远端结肠中占主导地位，表明 DSS 诱导的结肠炎是 UC1 的临床相关实验模型.远端结肠中更高水平的损伤/组织修复是否取决于微生物群、宿主对微环境的反应，或者只是不同的动力学，仍有待解决。
在稳态条件下，我们确定了与淋巴结构相关的分子特征。与在小鼠小肠中肉眼可见的 Peyer 斑块 (PP) 不同，CP 和 ILF 不能与结肠组织的其余部分分开进行解剖和分析，以进行转录组学读数。例如，在与稳定状态下覆盖淋巴簇的上皮层相对应的面向管腔的区域中检测到 NFkB 和 TNFa 通路活性的富集。由于这些途径通常与免疫激活/炎症反应相关，因此这些数据表明 ILF 相关上皮正在发生炎症。此外，发现单独的凝聚素 (Clu) 的表达具有高度特异性且足以定义分离的淋巴滤泡 (ILF)。先前的研究报告了 Clu 在滤泡树突细胞 (FDC) 中的表达，以及 Peyer 斑块中的 M 细胞。虽然 FDC 中的 Clu 表达可作为卵泡中生发中心 B 细胞的促存活因子，但 Clu 在 M 细胞中的作用尚不清楚。有趣的是，最近的一项研究将 Clu 确定为肠干细胞 (ISC) 的标志物，称为复苏干细胞，很少在稳定状态下发现，但主要存在于损伤后的再生肠中。 Clu 在 ILF 和滤泡相关上皮细胞中的表达是否在结肠感染和再生过程中具有任何影响需要进一步研究。
除了组织修复过程中转录组改变的近端-远端差异外，我们的 NNMF 分析显示远端结肠本身存在高度的区室化。至少有 5 个因素描绘了远端结肠中对组织损伤有不同生物学反应的地形和转录不同区域。这种异质性很可能是不同愈合程序的结果，例如皮肤样再上皮化（因子 7）、急性损伤（因子 14）和组织再生（因子 20）。支持这一观点，将我们的 RNAseq 动力学数据集整合到 ST 图显示远端结肠的某些区域在转录上更接近 DSS 结肠炎急性期（即 d6 到 d8）的样本。愈合过程的异步性质可能与不同程度地暴露于外部环境和组织的精细结构有关。同样，在人类 IBD 中，“炎症反应的斑块状”是克罗恩病的一个众所周知的特征。在 UC 中，传统上认为炎症随着远端结肠的强度增加而持续，但纵向取样显示宏观和微观炎症斑块状发作。因此，我们的数据集提供了一种宝贵的资源来询问组织愈合的不同时间和生物过程背后的转录程序。
PROGENy 可以预测结肠特定区域中激活的通路。 作者的分析揭示了通路活性（例如 TNFa 和 NFkB）之间的强相关性，表明一种通路可能完全依赖于另一种通路。 还发现损伤区域的特征是在稳态条件下在 ILF 边缘也增加了几个通路，这表明淋巴滤泡的形成导致损伤相关通路的诱导。 最后，降低 p53 活性代表了识别与损伤相关的增殖隐窝的好策略。 这些数据表明，在同一区域内，肠隐窝对损伤的反应是异质的。
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