PD-1是T细胞上的一种著名免疫检查点蛋白，当其与肿瘤细胞上的PD-L1结合时，可促进肿瘤免疫逃逸。虽然PD-1/PD-L1阻断疗法已用于多种实体瘤，如非小细胞肺癌（NSCLC）和黑色素瘤，但仅有部分患者表现出临床获益。药物抵抗仍然是PD-1/PD-L1阻断疗法的一个重大挑战，因此确定病人精准治疗分层的分子标志物、揭示药物抵抗背后的分子机制、进而确定能够克服药物抵抗的癌症联合用药变得至关重要。
善用CTR-DB（http://ctrdb.cloudna.cn/）数据库，就能轻松搞定上述问题。
CTR-DB是国家蛋白质科学中心（北京）发展的病人来源的具有癌症治疗响应信息的临床转录组数据库，文章发表在2022年的Nucleic Acids Res期刊上。数据库收集了626个具有用药响应（以及不响应）信息的治疗前临床转录组数据集，涉及275种癌症治疗方案、28种癌症组织类型。这些数据以及丰富的数据分析功能助力药物抵抗机制及其异质性探索、联合用药发现，特别是标志物验证功能支持基于病人临床转录组的癌症药物响应标志物发现和验证。
利用CTR-DB单数据集分析功能揭示抵抗机制
为了探索PD-1/PD-L1抑制剂治疗肺癌患者的抵抗机制，我们利用CTR-DB中的CTR_RNAseq_197数据集。该数据集包含27例接受PD-1/PD-L1抑制剂治疗的非小细胞肺癌（NSCLC）患者，其中19例不响应，8例呈现出临床获益。
首先利用CTR-DB提供的单数据集分析功能，借助于其中的“抵抗信号分析->差异表达基因（DEG）”功能，我们发现在不响应患者中PD-L1表达显著下调（即CD274，log FC = −1.15，P-value = 0.02）。
随后使用 “抵抗信号分析->基因集富集分析（GSEA）”分析模块，结果显示PD-L1上游的JAK-STAT通路显著下调（NES = −1.49，P-value = 2.31e−04），JAK-STAT信号通路上游的IFN-γ（IFNG）表达显著下降（log FC =−1.82，P-value = 0.03）。与此同时，抗原加工和递呈信号通路也显著下调（NES = −2.55，P-value = 2.10e−10）。
而“肿瘤微环境分析”结果表明，在不响应样本中，免疫细胞的比例（“ImmuneScore ”，log FC = −0.64，P-value = 0.10），特别是CD8+ T细胞的丰度（log FC = −1.32，P-value = 0.05）显著更低。这与差异表达基因的分析结果是一致的，因为在抗肿瘤免疫中，CD8+ T细胞是IFN-γ产生的关键来源之一[1]。
IFN-γ是一种二聚化的可溶性细胞因子，是II型干扰素的唯一成员，它作为一种多效应的细胞因子，能够参与体内获得性免疫和固有免疫应答[2]。在CD8+ T细胞浸润水平较低且抗原呈递通路活性下调时，CD8+ T细胞识别肿瘤抗原这一过程会受到阻碍，从而导致IFN-γ表达水平降低。低表达的IFN-γ不能有效地与JAK-STAT通路上的IFN-γ受体结合，进而造成JAK-STAT通路下调，进而下游PD-L1的表达量降低[3]。
以上所有结果暗示低的免疫细胞浸润，尤其是低CD8+ T细胞浸润，以及下调的INF-γ-JAK-STAT级联所引起的PD-L1的低表达可能是肺癌患者对抗PD-1/PD-L1治疗抵抗的分子机制。该发现与前人研究结果一致[3]。
利用CTR-DB单数据集分析功能发现联合用药
为了进一步发现克服PD-1/PD-L1阻断治疗抵抗的候选增敏药物，我们继续使用单数据分析功能中的“抵抗信号分析->L1000CDS2分析”来寻找能够逆转抵抗信号（|log FC|>=1，校正后的P值<=0.05）的药物。结果显示在返回的前50个药物信号中，有15个是组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACI），这暗示当免疫浸润程度较低且PD-L1低表达时，HDACI是很有希望的对抗PD-1/PD-L1阻断治疗抵抗的增敏候选药物。
事实上，前人研究表明，一方面HDACI可以增强抗原呈递和CD8+ T细胞及NK细胞浸润[4-6]，另一方面，HDACI还可以刺激PD-L1的表达，抑制随后的T细胞活化[7]。因此，HDACI联合PD-1/PD-L1抑制剂可以招募免疫细胞增强治疗敏感性，同时避免发生免疫逃逸。确实，目前“HDACI和PD1/PD-L1阻断剂”药物联用已经处于治疗NSCLC的临床试验中[8]。
CTR-DB数据集联合分析进一步验证了上述抵抗机制
为了在更大的患者群体中验证上述发现，通过CTR-DB的“Combine”功能合并所有接受抗PD-1/PD-L1治疗的CTR-DB数据集，这些数据集共涉及143个样本，其中包括47个响应样本和96个不响应样本；涉及的抗PD-1/PD-L1药物包括Nivolumab、Pembrolizumab、PD-1/PD-L1抑制剂，涉及的癌症类型有肺癌、黑色素瘤和皮肤癌。在这个更大的合并数据集上，我们获得了与上述发现一致的结果。例如，在合并后的数据集中，不响应样本中免疫细胞的浸润水平较低（‘ImmuneScore’，log FC = -1.08，P-value = 3.17e−03），特别是CD8+ T细胞的浓度（log FC = -1.13，P-value = 3.88e−03），相较于之前的单一数据集，这在合并后的更大群体中显得更为显著。
CTR-DB数据集比较分析揭示抵抗机制异质性
利用该数据库的“Compare”功能，进一步比较多个不同来源的接受PD-1/PD-L1抑制剂治疗的CTR-DB数据集，以揭示抵抗机制异质性。在CTR-DB中共有三个样本量>=10的数据集，包括非小细胞肺癌数据集CTR_RNA_197、黑色素瘤数据集CTR_RNAseq_11和转移性黑色素瘤数据集CTR_RNAseq_179。
比较分析结果显示药物抵抗机制在不同的病人群体中表现出高度的异质性。比如，与响应样本相比，CTR_RNAseq_179中不响应的转移性黑色素瘤患者的免疫细胞浸润程度略高（“ImmuneScore”，log FC = 0.11，P-value = 0.76；CD8+ T细胞，log FC = 0.99， P-value = 0.36），JAK-STAT通路上调（NES = 0.90，P-value = 0.71），PD-L1表达上调（log FC = 0.23, P-value = 0.69），同时NK 细胞介导的细胞毒性通路上调（NES = 1.24，P-value = 0.08）等，这些结果暗示CTR_RNAseq_179中不响应患者具有与上述CTR_RNAseq_197明显不同的药物抵抗机制。事实上，由于肿瘤的高度异质性，药物抵抗机制也被发现具有高度异质性和复杂性[3]。
利用CTR-DB标志物验证功能进行病人治疗分层的标志物验证
PD-L1在临床上已被广泛用作识别抗PD-1/PD-L1治疗响应的预测标志物[3]。此处想再利用CTR-DB患者的临床转录组数据来验证PD-L1的预测能力。
通过“生物标志物验证”功能，我们发现PD-L1只有在CTR_RNAseq_197病人群体上表现出了预测药物响应的能力（ROC AUC = 0.78，P-value = 3.60e−03），而在CTR_RNAseq_11和CTR_RNAseq_179上，它的预测能力都不足（CTR_RNAseq_11：ROC AUC = 0.54，P-value = 0.73；CTR_RNAseq_179：ROC AUC = 0.60，P-value = 0.38）。这个结果验证了之前的知识，PD-L1表达在预测治疗响应上的预测准确性是不够的。PD-L1阳性患者不一定总是对药物有响应，阴性患者也不一定对药物没有响应[3]。因此，需要更有效的联合生物标志物来预测PD-1/PD-L1抑制剂的药物响应。
总之，该案例分析表明CTR-DB在药物抵抗机制及其异质性揭示、增敏药物发现以及标志物验证等方面的潜力和靠谱性。
对相关研究感兴趣的小伙伴们赶快去试试吧！
参考文献：
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