picard 使用

https://broadinstitute.github.io/picard/picard-metric-definitions.html
https://broadinstitute.github.io/picard/index.html
picard 是一套命令行组成的工具包，用于处理高通量数据以及SAM/bam/VCF等相关数据格式。相关文件格式见说明 Hts-specs， SAM specification and the VCF specification.

使用方法：

java jvm-args -jar picard.jar PicardToolName OPTION1=value1 OPTION2=value2...

所有工具

    1. AlignmentSummaryMetrics: 统计比对结果（SAM/BAM）, 由CollectAlignmentSummaryMetrics生成，结果在文件.alignment_summary_metrics中。

  1. BaseDistributionByCycleMetrics: *

  2. ClusteredCrosscheckMetric: 处理聚类的 crosschecking fingerprints结果*

  3. CollectHiSeqXPfFailMetrics.PFFailDetailedMetric: a metric class for describing FP failing reads from an Illumina HiSeqX lane *

  4. CollectHiSeqXPfFailMetrics.PFFailSummaryMetric: Metrics produced by the GetHiSeqXPFFailMetrics program.*

  5. CollectOxoGMetrics.CpcgMetrics: Metrics class for outputs.*

  6. CollectQualityYieldMetrics.QualityYieldMetrics: 用于描述 BAM 比对质量的一些指标。*

  7. CollectRawWgsMetrics.RawWgsMetrics: *

  8. CollectVariantCallingMetrics.VariantCallingDetailMetrics: 给定文件的 VCF 文件，与 SNP 和 Indel 相关的指标。*

  9. CollectVariantCallingMetrics.VariantCallingSummaryMetrics: 同上*

  10. CollectWgsMetrics.WgsMetrics: 用于评估全基因组测序结果。*

  11. CollectWgsMetricsWithNonZeroCoverage.WgsMetricsWithNonZeroCoverage: 同上*

  12. CrosscheckMetric: 处理 crosschecking fingerprints结果*

  13. DuplicationMetrics: 对 SAM 标记 duplicates，并计算相关指标。*

  14. ErrorSummaryMetrics: CollectSequencingArtifactMetrics 计算的summary 指标，计算每种碱基错误率。*

  15. ExtractIlluminaBarcodes.BarcodeMetric:
    ExtractIlluminaBarcodes计算的指标，分析 Basecalling 目录下的数据，确定每个reads 和 barcode 的关系。*

  16. FingerprintingDetailMetrics: fingerprint 内，单个 SNP/杂合体 比较的详细指标。*

  17. FingerprintingSummaryMetrics: 总结 fingerprinting 指标，统计比较测序数据。*

  18. GcBiasDetailMetrics:
    Class that holds detailed metrics about reads that fall within windows of a certain GC bin on the reference genome.*

  19. GcBiasMetrics: *
    GcBiasSummaryMetrics: High level metrics that capture how biased the coverage in a certain lane is.*
    GenotypeConcordanceContingencyMetrics: Class that holds metrics about the Genotype Concordance contingency tables.*
    GenotypeConcordanceDetailMetrics: Class that holds detail metrics about Genotype Concordance*
    GenotypeConcordanceSummaryMetrics: Class that holds summary metrics about Genotype Concordance*
    HsMetrics:

    Metrics generated by CollectHsMetrics for the analysis of target-capture sequencing experiments.

详细功能

CollectHsMetrics:

分析靶向测序（hybrid-selection）的相关指标

该命令读取SAM/BAM文件。HS（杂交捕获，靶向测序，hybrid-selection）是靶向测序常用的技术，如外显子靶向测序，更多信息参考GATK Dictionary entry.

该命令需要
1）比对结果（SAM/BAM）
2）捕获位点信息（靶向试剂盒生产商提供）。若捕获位点是 bed 格式，则需要 BedToInterval 工具转换为 picard 所需的 interval_list 格式。
3）若有参考序列，则会同时计算 AT_DROPOUT and GC_DROPOUT 指标。
因为某些区域GC含量过多或过少，会使测序错误率增加，然后导致比对到这些区域的reads变少，即比对效率降低，覆盖度降低。

你可以使用 PER_TARGET_COVERAGE，获取每个捕获位点的GC含量和测序深度等信息。
标为 pct 的指标都是比例。

java -jar picard.jar CollectHsMetrics \
      I=input.bam \
      O=hs_metrics.txt \
      R=reference_sequence.fasta \
      BAIT_INTERVALS=bait.interval_list \
      TARGET_INTERVALS=target.interval_list
 # BAIT_INTERVALS 可以与 TARGET_INTERVALS 相同（但我还不太明白）

bait 与 target 区别:
计算 bait coverage 时，很少去除 reads，因此可以直观感受湿实验效果，但是计算 target coverage 时，因为对突变检测的贡献有限，去除了很多碱基。可以看一下各种 PCT_EXC 指标的描述，为什么在计算 target 时，过滤掉很多 reads 。大部分过滤条件可以通过参数调节。

详细的结果说明查看 CollectHsMetrics
CollectHsMetrics 分析的指标分为三类。
1 ) 基本测序指标，用来计算其他指标。比如基因组大小，reads 总数，比对的 reads 总数。
bait_set： 捕获杂交用的 bait 名称
bait_territory：位于一个或多个 bait位点的碱基数量
target_territory：覆盖在target区域 unique base数量
bait_design_efficiency：设计效率。 target_territory/bait_territory 比例。值为1 表示设计效率极好，0.5表示一半 bait 碱基不在taget区域。
PF_READS：通过vendor's 过滤的reads总数。
PF_BASES_ALIGNED ：通过碱基质量控制（PF），且比对到基因组（比对分值>0）上 unique 碱基。
on_bait_bases： 比对到基因组 bait 区域的 （PF_BASES_ALIGNED ）碱基数量。
genome_size
total_reads： SAM 文件中 reads 总数。
pf_reads：通过平台/vendor 质控的 reads 总数。
pf_bases：PF_READS 的碱基量。
pf_unique_reads：非重复 reads
pf_uq_reads_aligned： 比对reads中 unique 比例
pf_bases_aligned：比对上的碱基总数。
pf_uq_bases_aligned： 比对 reads 中 unique reads 的碱基总数
on_target_bases： 比对到 target 区域的碱基总数
pct_pf_reads：下机数据中通过质控的 reads 比例。
pct_pf_uq_reads：下机数据中通过质控且无重复的 reads 比例
pct_pf_uq_reads_aligned：通过质控的reads中，比对到reference 的无重复 reads 比例

2 ) 实验质量，比如比对到 bait 附近、内部、外部的碱基数量或比例， fold 80 碱基罚分，捕获文库大小，捕获罚分。在过滤之前得到这些指标，比如低比对质量，低质量碱基，重复reads。
near_bait_bases：比对到 bait 附近的 reads 碱基量。 即有部分重叠。
off_bait_bases：没有比对到 bait 区域的碱基量。
pct_selected_bases：（near_bait_bases+on_bait_bases）/PF_BASES_ALIGNED
pct_off_bait：off_bait_bases/PF_BASES_ALIGNED。
on_bait_vs_selected：on-taget 中bait 完全覆盖的比例。

fold_80_base_penalty：测序均一度指标，非0覆盖区域上，使80%碱基达到平均coverage时，需要另外测序的倍数。值越低越好，最好值为1。

hs_library_size：被捕获的文库片段数量估计值
hs_penalty_10x：80% 靶向区区域碱基达到 10X时的捕获罚分。即：当设计10M的靶向区域时，要得到 10X coverage， 需要测序，直到 PF_ALIGNED_BASES =10^7 * 10 * HS_PENALTY_10X.
hs_penalty_20x：想要80%区域到达 20X coverage。
hs_penalty_30x
hs_penalty_40x
hs_penalty_50x
hs_penalty_100x

3）target 覆盖度评估，评估下游分析中的可靠性。比如target 区域平均覆盖度，不同覆盖度水平的碱基比例，不同条件过滤的碱基比例。按照所有条件过滤后计算这些指标。
mean_bait_coverage：所有 bait 位点上的平均覆盖度。
pct_usable_bases_on_bait： 可使用的 PF 碱基中，比对到 bait 上的去重的碱基数量。
pct_usable_bases_on_target： 可使用的 PF 碱基中，比对到 target 上的去重的碱基数量。
fold_enrichment：扩增区域被扩增的倍数
mean_target_coverage： target 区域平均覆盖度。
median_target_coverage：覆盖度
max_target_coverage：覆盖度
min_target_coverage：覆盖度
zero_cvg_targets_pct：target 区域覆盖度<1的比例。

不同条件过滤的碱基比例：
pct_exc_dupe：标记为重复的 reads 。
pct_exc_adapter：adapter
pct_exc_mapq：低比对质量
pct_exc_baseq： 低碱基碱基。
pct_exc_overlap： 重复序列比例。 the second observation from an insert with overlapping reads. ？？？
pct_exc_off_target： 比对到 taget 区域外。

不同覆盖度水平的碱基比例：
pct_target_bases_1x：比对到target 区域的，不小于 1X的碱基比例
pct_target_bases_2x
pct_target_bases_10x
pct_target_bases_20x
pct_target_bases_30x
pct_target_bases_40x
pct_target_bases_50x
pct_target_bases_100x
at_dropout：与平均覆盖度相比，低碱基含量（GC<50%）的区域，偏低的程度。结果是个比值，表示总reads中比对到 低 GC含量区域的比例。
gc_dropout：高 GC含量的区域上 reads 比例。

het_snp_sensitivity：HET SNP 理论值。
het_snp_q：HET SNP 理论值的 Q 值，
sample
library
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