在生命科学研究和生物制药领域，原代细胞的获取是许多实验的起点，而成功分离活性高、完整性好的细胞，关键在于高效且温和的组织解离技术。在这一过程中，胶原酶 扮演着无可替代的核心角色。它并非一种单一的酶，而是一个精心设计的酶系复合物，其组成与活性的精准把控，直接决定了细胞分离的成败。
一、胶原酶的本质：一个协同作用的酶复合物
粗制胶原酶制剂是一个复杂的混合物，其主要包含两种不同胶原酶的多种亚型，并辅以其他几种蛋白酶活性，包括：
胶原酶：核心成分，负责特异性水解天然胶原蛋白。胶原是细胞外基质中最主要的纤维性蛋白，构成了组织的物理支架。
梭菌蛋白酶：一种巯基蛋白酶，具有特定的蛋白水解活性。
胰蛋白酶样酶：发挥类似胰蛋白酶的消化作用。
氨肽酶：从多肽链的末端开始降解。
这种胶原溶解活性与蛋白水解活性的组合，共同作用，能有效瓦解细胞间的胶原网络和其他蛋白成分，从而实现组织的温和解离。
胶原酶的作用机制非常特异。它是一种水解酶，能够优先切割天然胶原蛋白三螺旋结构中的特定肽键——序列Pro-Y-Gly-Pro中的Y-Gly键（Y通常是一个中性氨基酸）。这种切割使得坚固的胶原螺旋结构解体，产生的片段随后更容易被其他肽酶进一步消化。
胶原酶的活性依赖于Ca²⁺的存在，并受到金属离子螯合剂（如半胱氨酸、EDTA、邻二氮菲）以及大型血浆糖蛋白α2-巨球蛋白的抑制，但对DFP（二异丙基氟磷酸酯）不敏感。
二、Worthington胶原酶的分类：因“组织”制宜的科学
研究人员很早就发现，不同组织由于其细胞外基质组成和密度的差异，需要不同酶活性谱的胶原酶来实现最佳解离效果。因此，全球知名的酶制剂供应商Worthington根据酶活性的不同平衡，建立了一系列标准化的粗制胶原酶类型，主要包括Type1,2,3,4,5,6,7。
每一种类型都是为特定应用场景设计的：
Type1：保持了最初的胶原酶、酪蛋白酶、梭菌蛋白酶和胰蛋白酶活性的平衡，是一种通用型选择。
Type2：含有更高水平的蛋白酶活性，特别是梭菌蛋白酶，适用于富含结缔组织的坚韧器官，如肝脏、心脏等。
Type3：含有最低水平的次级蛋白酶，适用于对蛋白酶敏感的组织或细胞表面受体需要高度保护的实验。
Type4：特意设计为极低的胰蛋白酶活性，以最大限度地减少对膜蛋白和受体的损伤，是分离对胰蛋白酶敏感的细胞（如内皮细胞、肝细胞）的理想选择。
Type5&7：提供更高的胶原酶和酪蛋白酶总体活性，适用于需要更快速或更强力解离的组织。
Type6：具有高胶原酶活性，且酪蛋白酶与胶原酶的比例约为2:1，特别富集了II型胶原酶，在解离某些对胶原酶类型比例敏感的组织（如脂肪组织、胰岛）时表现优异。
对于需要极致纯度的应用，Worthington提供了胶原酶，6型货号：WBC-LS005319。这类产品去除了绝大部分次级蛋白酶，仅保留高水平的胶原酶活性，研究人员可以在此基础上，按需精确添加特定种类的辅助酶，实现完全定制化的解离方案。
三、创新与发展：无动物源与即用型解决方案
随着生物制药行业对生产安全性和法规遵从性要求的提高，无动物源胶原酶应运而生。这类新型胶原酶在完全不含动物源性成分的培养基中生产，旨在杜绝引入外源病毒或病原体的风险，特别适用于细胞治疗、疫苗生产等生物工艺过程。
Worthington的AFA,AFB,AFC,AFD和AFP系列无动物源胶原酶，分别模拟了传统Type1,2,4等类型的酶活性谱，并提供了更高比活性的选项，确保了从研发到生产过程的顺利衔接。
此外，为了提升实验的便利性和可重复性，Worthington还推出了：
STZ1&STZ2：经过0.22微米过滤的STEMxyme®胶原酶/中性蛋白酶混合制剂，专为原代细胞和干细胞分离优化，确保无菌。
预包装过滤产品：每种类型的胶原酶都提供预先分装并经过0.22um过滤的规格，可直接复溶使用，大大简化了操作步骤，降低了污染风险。
四、应用策略与选择指南
粗制胶原酶被广泛应用于原代细胞分离和组织解离流程。大多数研究人员会根据目标组织的特点，选择Type1,2,3,4等粗制产品，或者选择纯化胶原酶再自行与弹性蛋白酶、透明质酸酶、中性蛋白酶等组合使用。
“没有最好，只有最合适”是选择胶原酶的金科玉律。虽然酶的类型与组织解离效果之间存在良好的相关性，但并非绝对。实验参数、操作者的具体流程以及不同批次间的微小差异都可能影响最终结果。因此，Worthington提供了胶原酶取样计划和详尽的《组织解离指南》，帮助研究人员根据大量文献和实践经验，为其特定组织选择最合适的酶类型和解离条件。
相关产品生态也体现了胶原酶应用的协同性。在解离过程中，常会配套使用脱氧核糖核酸酶I来降解释放的DNA以减少粘度，使用透明质酸酶消化透明质酸，使用中性蛋白酶进行进一步的蛋白水解。沃thington还提供了一系列集成的细胞分离系统，如肝细胞分离系统、新生儿心肌细胞分离系统等，为用户提供了经过优化的、即用型的完整解决方案。
五、质量控制与单位定义
Worthington对胶原酶的质量控制极为严格。其胶原酶活性检测基于改良的Mandl法：在37°C、pH7.5条件下，将胶原酶与天然胶原蛋白孵育5小时，然后使用Moore和Stein的茚三酮比色法测定胶原的分解程度。一个酶活力单位定义为在上述条件下，每分钟从胶原蛋白中释放出相当于1微摩尔亮氨酸的产物所需的酶量。
参考文献：
Abe, S. and Nagai, Y.
Evidence for the Presence of a Complex of Collagenase with alpha-2-Macroglobulin in Human Rheumatoid Synovial Fluid: A Possible Regulatory Mechanism of Collagenase Activity , J. Biochem. 73 , 897 , 1973
Adams, E. , Antoine, S. and Golstein, A.
Collagenase Action on the Synthetic Tripeptide Polymers, (Gly-Pro-Ala)n and (Gly-Ala-Pro)n , Biochim Biophys Acta 185 , 251 , 1969
Ala-aho, R. and Kahari, V.
Collagenases in Cancer , Biochimie 87 , 273 , 2005
