学习内容：

怎么区分一二三代测序
二代测序大体流程
NGS组学都包括哪些分类（粗略）

1. 测序过程和原理

公司是怎样测序的，数据怎么来的？
现在的测序平台基本都是illumina公司出品的，所以先看一下他们的原理介绍视频，查一下专业术语。
原理介绍视频：https://share.weiyun.com/5qojuBY 密码：密码：bxsry4
文章《测序的世界》：https://www.jianshu.com/p/101c14c3a1d2

这一篇初学者暂时只看测序原理部分;
若有疑问：搜狗微信—搜索“测序原理” 。

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1.1 第一代测序技术

来源：1、2、3、4代测序技术原理详解！
【陈巍学基因】视频25：第一代DNA测序

第一代测序技术-Sanger法测序，Sanger法是基于DNA合成反应的测序技术，又称为SBS法、末端终止法、双脱氧法测序。1975年由Sanger提出，并于1977发表第一个完整的生物体基因组序列。

核心原理：由于双脱氧核苷酸(ddNTP)的3’位置脱氧，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA合成反应，在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP（分为：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显影，根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列。

在每个反应体系中，ddNTP相对于dNTP是很少的，所以只有部分新链在不同的位置特异性终止，最终就会得到一系列长度不一的序列。

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图片来源：https://mp.weixin.qq.com/s?__biz=MzU4NjU4ODQ2MQ==&mid=2247483720&idx=1&sn=c28fe56afdbe788a65f98d79eae89189&chksm=fdf8490aca8fc01c4b5d4b4347cc31d78626f7d9a57c4fce10d74c011a836e583a5045f4a1bf&scene=21#wechat_redirect

1.2 第二代测序原理

来源：1、2、3、4代测序技术原理详解！

以Illumina平台为代表的第二代测序技术实现了高通量测序，有了革命性进展，使得大规模并行测序成为现实，极大推动了生命科学领域基因组学的发展。Illumina循环SBS法(cycle SBS)即SBRT(Sequencing By Reversible Termination,可逆终止)的核心技术是DNA合成的可逆性末端循环，即3'-OH可逆性的修饰和去修饰。

基本原理：将dNTP的3'-OH以叠氮集团RTG(Reversible Terminating Group,可逆末端基团)进行修饰；将4种碱基分别与不同的荧光分子连接；DNA合成时，RTG能起到类似于ddNTP的作用终止反应；每次合成反应终止并读取信号之后，洗脱RTG和荧光分子，进行下一轮循环。

主要过程：
a, DNA待测文库构建
利用超声波把待测的DNA样本打断成小片段，并在这些小片段的两端添加上不同的接头，构建出单链DNA文库。这些文库中的DNA在通过flowcell(吸附流动DNA片段的槽道)时会随机附着在flowcell表面的channel上。每个Flowcell有8个channel，每个channel的表面都附有很多接头，这些接头能和建库过程中加在DNA片段两端的接头相互配对，并能支持DNA在其表面进行桥式PCR的扩增。

Illumina测序一般流程:

（1）文库制备，将DNA用酶切或超声波随机片段化成几百碱基或更短的小片段。通过填充和核酸外切酶把DNA片段补成平末端，紧接着磷酸化并增加一个dATP核苷酸黏性末端。然后将Illumina测序接头与片段连接。

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（2）簇的创建，将模板分子加入测序板 (flow cell) 用于产生克隆簇和测序循环。芯片有8个纵向泳道（lane）的硅基片。每个泳道内芯片表面有无数的被固定的单链接头。一个Flow cell可以测定多个样品，我们可以一段barcode来区分不同样品（通常barcode存在与adaptor与测序片段之间）。所以如果你的样品较少，公司不会给你单独上机测序，要等样品足够多，一次性上机。