提取质粒

本文主要以OMEGA试剂盒（产品编号#D6950）为例，讲述下提质粒（去内毒素）的注意事项。

1. 实验原理

DNA在化学性质上是懒惰的，但是在物理结构上是易碎的。因为在化学上其潜在的反应基团隐藏在中央螺旋部位，并经氢键紧密连接，同时碱基外侧受磷酸键和戊糖形成的强大环层的保护，这种保护因内在的碱基堆积力而进一步加强；在物理上，其长而弯曲，侧面不稳定，更容易受到柔和剪切力的破坏。双链DNA在溶液中随机卷曲，并由于碱基之间的堆积作用和DNA骨架上磷酸基团之间的静电排斥力而变得粘稠，所以在移液、震荡或搅拌引起的液流中，在粘滞的盘绕物上产生的拖拉力，很容易切断双链DNA。DNA越长，破坏其所需的力越小，大于150kb的DNA分子在常规分离基因组DNA过程中易于断裂。

2. 实验步骤

一般DNA分离提纯可以简单分为三步：
裂解宿主细胞。如，
离子去污剂，如SDS
从细胞中释放DNA，去除与DNA结合的蛋白质并快速使胞内核酸酶失活。如，
酶水解蛋白和RNA
层析液中吸收、释放DNA
利用乙醇或者异丙醇沉淀DNA去除盐离子。

菌液在高PH条件下，加入强离子去污剂（如，SDS）能够破坏细胞壁，是蛋白质与染色体DNA变形，并将质粒DNA释放到上清液中。但是在实验中关键是动作要快，因为长时间暴露在变形条件下会对闭环DNA造成不可逆性。这种变性的折叠卷曲DNA不容易被限制性内切酶切割，它的琼脂糖电泳速率是线形、超螺旋和环状等天然结构DNA电泳速率的2倍，并且不容易被嵌入染料染色。碱裂法在制备治理过程中常会产生不同数量折叠形式的DNA。上述这种方法适用于15kby以下的质粒，大于15kb的质粒在提取过程中很容易断裂，可用等渗蔗糖溶液裂解细菌，并用溶菌酶和EDTA（乙二胺四乙酸）去除细胞壁，可解决受损。产生的原生质球可通过加入去污剂（如SDS）被裂解。

试剂盒一般采用DNA选择性吸附稳定固相（通常是二氧化硅或者硅酸盐）的特性进行DNA纯化。在高PH、高盐缓冲液中，DNA会吸附到二氧化硅介质上面，在低盐浓度下可被洗脱下来。玻璃表面的阳性粒子随后可以在DNA骨架中磷酸负电基团和硅醇负电基团（Si-OH）之间形成盐桥，结合强度与成桥离子类型有关。一旦DNA与介质结合，他就会与其他的生物多聚物（如RNA和糖）分开。得率由DNA大小决定，片段越小，与二氧化硅结合越紧密，得率越低。

2.1 实验前准备

实验开始前，最主要的是细菌培养。试剂说明书建议使用DH5α，DH1，C600，都可以，XL1-Blue虽然长
的很慢但是也可以使用。其次培养基的使用建议采用LB培养基，其他的均不建议。

开始细菌培养前，最好涂板调菌培养，这样可以保持菌的活性，甘油保存的菌可能会产量低或者质粒丢失。
当挑取单菌落后放入37℃，300rpm，培养12~16h。

为了获得最佳质粒产率，起始培养体积应基于培养细菌密度。建议使用OD600的2.0和3.0之间的细菌提取质粒。使用富含营养素的介质时，应注意确保细菌密度不超过3.0的OD600，最后菌液OD600为0.4。在推荐的OD范围之外使用高密度培养可能会超过纯化体系。

注意：
曝气是很重要的，LB培养基的体积应该是容器的1/4
随着培养时间的加长，由于细菌的死亡和裂解，DNA的产量开始下降。

2.2 实验具体操作

在平盘上面挑取单菌落，接种到10-15ml LB包含抗性的新鲜培养基中，培养12-16h在300rpm、37℃环境中。在体积大于培养基4倍的容器中培养细菌，OD600的2.0和3.0之间的细菌提取质粒。
室温，离心5000xg，10min。
完全倒掉上清。
加入500ul Solution I。涡旋或者上下颠倒完全混匀。重悬完全细菌集团是获取高产量DNA的关键。
转移细菌悬液到新的2ml离心管中。
加入500ul的Solution II。温柔的倒置旋转离心管几次为了获得干净的裂解液。孵育2-3min是很有必要的。
- 注意：避免剧烈混合，因为这将剪切染色体DNA和降低的质粒纯度。不要让裂解反应超过5分钟。在不使用Solution II的时候应该紧密盖住以避免空气中的CO2使其酸化。
加250μL预冷N3缓冲液。轻轻翻转几次，直到形成白色絮状沉淀。
- 注意：N3必须混合充分。如果混合物看起来仍然粘稠、呈褐色和团块，则需要更多的混合才能完全中和溶液。溶液的完全中和对于获得良好的产量至关重要。
以最大速度离心(≥13000 x g），持续10分钟。一个紧凑的白色颗粒将形成。迅速进行下一步。
将清除裂解物转移到新的1.5ml微量离心管中。测量转移的清除裂解物的体积。
添加0.1体积的ETR溶液，倒置10次混合充分。
冰上孵育10min，在孵育期间颠倒离心管几次。
- 注意：在加入ETR溶液之后，裂解液应该出现浑浊，但是在冰上孵育之后应该变得澄清。
在42℃水浴锅中孵育5min，溶液应该再次浑浊。
25℃，离心12000xg 3min。ETR溶液应该形成蓝色沉淀在管底。
转移上清到新的1.5ml离心管中，加入0.5体积的无水乙醇。轻轻颠倒混匀6-7次。在室温中孵育1-2min。
准备好柱子插入2ml的收集柱中。
- 可选：可将100ul的3M NaOH加入到柱子中，最大转速离心30-60s，然后倒掉过滤废液重新使用。有的时候柱子放的太久了可能需要重新活化一下。
转移第14步的混合液700ul到柱子当中。
最大转速离心1min。
丢弃收集柱中的废液，重新套上收集柱。
重复第16-18步直至混合液体离心完。
加入500ul HBC Buffer。
最大转速离心1min。
丢弃收集柱中的废液，重新套上收集柱。
加入700ul DNA Wash Buffer.
最大转速离心1min。
丢弃收集柱中的废液，重新套上收集柱。
重复一次23-25步骤
最大转速空管离心2min，是柱子甩干。
- 注意：在加入洗脱液之前，柱子必须是干的。残留的乙醇会对后续试验造成影响。
将柱子转移到干净的1.5ml离心管上。
加入80-100ul Elution Buffer或者无菌的去离子水到柱子中间。
- 注意：洗脱DNA溶液的PH是收集DNA效率的关键，PH最好是在8.5。
室温孵育1min。
最大转速离心1min。
- 注意：这时候大约70%的DNA被洗脱下来，可以在产量低的时候，选择回收1.5ml离心管中的Elution Buffer第二次洗脱。
-20℃储存。

2.3 故障排除

Fig1

Fig2

3 特别注意

去除干净废液：在每一步的去掉废液都十分关键，其中最为关键的是去除细菌培养基，剩余的培养基会影响质粒提取质量。
Solution I ：加入后注意彻底涡旋混匀，必须对光观察直至看不到有任何菌体颗粒。
Solution II：Solution II试剂是整个裂解细菌过程中最关键的试剂。在加入碱性裂解液Solution II的时长需要特别注意，如果时间过短，裂解不充分DNA浓度低，如果时间过长，质粒长时间暴露碱性溶液，其结构会改变导致后期酶切切不断，或者转染效率低。碱性的Solution II长时间暴露在空气中，导致其裂解能力下降。低温下，Solution II有沉淀析出，应该在37℃下是沉淀溶解，否则导致其裂解能力下降。
ETR Solution：此试剂使用时，需要格外注意温度，因为在低温下ETR不会产生沉淀，所以一般是在常温下离心，如果产生沉淀不明显，可以尝试延长离心时间。并且在产生沉淀的时候，吸取上清不要吸到蓝色沉淀，因为其含有大量毒素。
HBC Buffer：推测这个试剂作用应该是使DNA与膜结合。
洗脱体积：80-100ul体积最好不要改变，因为低于此体积可能导致洗脱不下DNA，因为与DNA结合的膜比较厚。
此试剂盒所有试剂体积都不要擅自改变。
质粒结构一般有三种分别是共价闭合环开DNA（cccDNA,SC构型）、开环DNA（OC构型）和线性分子（L构型）。一般存在细菌体内的是SC构型，尽管分子质量相同但是电泳过程中产生的摩擦力不同就导致其迁移速度不同，所以电泳可能产生三条带，速度最快的依次是SC、L、OC。
在判断质粒有没有酶切成功的时候，可以使用酶切产物与原质粒共同电泳，观察迁移速度。

4. 参考资料

1.分子克隆实验指南第四版

2.Omega官方说明书

质粒的提取