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从10月底开始，由克里克学院与康昱盛主办的蛋白质组学网络大课堂正式开班了，整个课程由21堂大课组成。作为蛋白质组学纯小白一枚，小编也打算借这个机会好好学习感受一下。继第一讲“蛋白质组学研究方法概述”以后，小编继续整理了第二讲“蛋白质谱实验样品前处理”的听课笔记，今天是第二部分，分享给各位。
第二讲听课笔记（一）链接
授课老师
这次课程的授课老师是来自复旦大学生物医学研究院（IBS）的刘晓慧博士。我们知道，IBS的杨芃原老师实验室是中国蛋白质组学领域综合实力最强的团队之一，刘老师就是在这里获得了她的化学生物学博士学位，并在杨老师实验室工作十余年。作为实验室的骨干力量，她拥有非常丰富的蛋白质谱实验技能与经验，并从事基于生物质谱的蛋白质和多肽定量方法的应用和开发，精通iTRAQ、MRM、MRM-HR、SWATH等相关技术，参与发表相关论文30余篇。刘老师在授课中详细分享了她在蛋白质谱实验样品前处理方面多年积累的珍贵经验与心得，这样的学习机会实属难得！
（文中所有图片均来自刘晓慧博士的讲义，并获得发表授权。）
上篇小编给大伙儿分享了样品收集保存、样品破碎和常用抽提试剂，不知道做实验的小伙伴们有没有从中学到一些技巧和经验呢？今天，小编将继续分享不同样品的蛋白提取方法，感兴趣的话，搬个小板凳，听小编跟你慢慢聊~
针对不同的样品类型，我们从中提取蛋白质的步骤和方法肯定是不同的。大概可以分为以下几类：
动物组织样品
动物细胞样品
石蜡包埋样品
植物组织样品
细菌样品
体液样品
从亚细胞器中提取蛋白
每一类样品，应该怎么处理呢，接下来听小编一一道来。
**动物组织样品
**
第一步：剪碎去血
将样品放入PBS缓冲溶液中剪碎，倒掉变色的溶液，换入新的PBS，继续剪，一遍一遍地重复，直到PBS溶液不变色为止。比如肝脏组织，洗完后整个是一个偏黄色的组织。在这个过程中，我们需要用剪刀和镊子剥离血管组织和脂肪组织等，这些组织的存在会对我们对样品，比如肝脏组织的蛋白质类型产生干扰。去血的过程中同时需要加入蛋白酶抑制剂。
第二步：称重
为了称量更精确，洗涤之后可以用滤纸将样品吸干，然后再称重，能比较准确地知道我们大约使用了多少组织样品。
第三步：碎裂
碎裂样品的方法在上一篇推文里有详细的介绍，包括液氮研磨、匀浆等机械破碎，温差法、压力法等物理破碎，以及加入变性剂等化学处理法。通常情况下呢，用液氮研磨就够了，研磨到完全变成粉状。但如果用单一的方法破碎效果不好，或者操作起来工作量太大，也可以进行多方法的组合。比如十几个或几十个样品，完全靠手工的液氮研磨，跟去健身房玩一圈的运动量估计也差不多了，累成狗！这时候可以考虑使用组织破碎仪，一次可以做八个十个的，一起震碎，那就轻松多了。
第四步：裂解
破碎以后，加入裂解液，反复震荡，让样品充分溶解，裂解液的用量通常是
组织重量：裂解液的体积=1：5
也就是说，1克组织，通常加入5ml的裂解液。
在裂解时，眼睛不要只顾着看手机或者盯着天花板发呆，要好好观察样品的情况，如果发现仍然有大块的组织，或者很多絮状的组织，则说明上一步碎裂的工作做得还不够。这时可以加入超声的方法，或者用组织匀浆器进一步碎裂，从而保证蛋白提取比较成功。
有哪些裂解液可选呢？
4%SDS，溶解性特别强，很适合对膜蛋白或疏水性蛋白的提取；
常规的8M尿素，也不弱。
Tips：如果用的是4%SDS，千万不要用超声进一步碎裂！因为SDS是一种强去污剂（十二烷基磺酸钠，我们平常用的洗衣粉里就有），如果进行超声，会产生大量的泡沫，既达不到很好地溶解样品的目的，又引来干扰，搞得我们很难控制提取蛋白的过程。
第五步：离心
裂解并震荡以后，4℃ 12000rpm离心半小时，然后吸取上清液。
特别注意：有些样品脂肪比较多，比如小鼠肝脏样品，可以看到提取时上面有很大一层浮油，下面还有一堆沉淀，如果是新手，又自我要求很高，通常会想要把所有清液都吸取出来，不浪费一点样品。这其实很难做到！弄得不好，就会带入脂肪组织和沉淀组织，给后续的实验引入污染，造成更多的损失，得不偿失啊！推荐的做法是：吸取离上层浮油及下层沉淀都有一定距离的中间部分，这样取出来的蛋白就纯净多了。
说到这里，插一句，以往的经验，常规小鼠和人的组织样品，提取效率大约为0.7%，也就是说，如果有100mg的组织，能提到的蛋白大概是700 μg 。做常规的质谱分析，有100-200mg的蛋白就够了。如果样品充足，我们可以分成几份，先提取一部分做实验试试，整个流程走下来没问题的话，再提一部分，这样也比较保险，不会出现全军覆没的惨剧。余下的样本，还可以做做Western验证或者酶活啥的。
如果样品量特别少，例如小鼠卵巢，一共也就黄豆那么大，这种情况下可不能用液氮研磨，因为大部分样品都会被刮到研钵的壁上，损失很大！可选的方案是：将小鼠卵巢放进试管里，直接在管子里剪碎去血，加入裂解液，用组织破碎仪或者超声破碎，也可以用4%SDS提取（ 95℃，5分钟）。这种情况就不要弄太多的碎裂步骤了，步骤越少，样品的损失就越少。
动物细胞样品
针对动物细胞样品的处理方法有很多，我们来看看几种常见的套路：
A． 最简单的方法：
把细胞从培养皿里取出来，先加入PBS把培养基洗掉，再加入裂解液，通常25mm的培养皿加入400-700μL裂解液。然后用细胞刮直接刮取培养皿表面，不停地刮，相当于是一个机械力的破裂，而细胞表面是最容易进行破裂的。刮完后收集裂解液和细胞样品到EP管里，然后进行冰上裂解。这是最快最直接有效的方法。
Tips：通过测试发现，蛋白质的保存比组织样品或细胞样品的保存来得更加稳定，所以拿到细胞后直接提取出来蛋白进行保存更好。
B．多组细胞平行实验处理方法：
当需要处理多组细胞，而每组细胞培养的时间有间隔时，如果希望后续的分析是平行的，那么可以先分别胰酶消化以后，收集每组细胞，液氮或者-80℃保存。等各组细胞都收集好后，加入裂解液，不超过200W超声，放在冰上操作。由于不能用SDS（超声时会引起大量的泡泡），这种情况下，常用的是8M尿素或2M硫脲。超声一定要在冰上进行，因为温度特别高，很容易超过37℃，循环周期的时间通常会设定为：5秒超声，停4-5秒，再5秒超声，反复，整个过程持续5分钟左右。
C．反复冻融法：
这种方法用得比较少，因为残留的细胞残片还是比较多，我们认为提取是不充分的。
D．化学处理法：
也是非常简单粗暴的方法，直接加入4%SDS，95℃水浴，1-5分钟即可。
通常情况下，我们要求细胞量需要达到1E6的数量级。当然，有一些新发展出来的方法，需要的细胞量会非常少，比较南方医科大学田瑞军老师课题组做过1000个细胞的蛋白提取，但这些新方法对操作的要求也很高，如果你还是个新手，没有足够的经验，直接拿新方法来做，风险就会比较高了。
石蜡包埋样品
对于这类样品的处理，去石蜡是比较麻烦的事情。在石蜡包埋过程中，样品中的蛋白质或脂肪会用福尔马林或甲醇固定，形成交联状的结构，从中提取蛋白是非常困难的。难归难，遇到了还是要迎难而上，咱们得想一些合适的办法把蛋白有效地提取出来。通过很多次的摸索和实践，以下是比较可行的处理步骤：
第一步：去石蜡，先用二甲苯室温浸泡5分钟，两次，再换甲醇室温浸泡5分钟，两次。看起来很简单，但整个过程中会经过混旋。
第二步：蛋白裂解，因为蛋白被福尔马林或甲醇固定得非常紧了，有的人会选择加入水，让样品泡涨，我们更推荐加入裂解液（0.1M Tris-HCI, pH 8.0, 0.1M DTT），充分水化被固定的蛋白样品，然后匀浆和超声。
第三步：水化之后，加入4%SDS。对于4%SDS，通常的处理条件是95℃，5分钟，但对于石蜡样品，交联特别厉害，所以推荐95℃下处理60分钟，再冷却到室温。
Tips：SDS并没有在第二步裂解的时候就加入，是因为这一步需要使用超声，如果加入了会产生大量的泡沫。所以我们先让样品在一个缓冲体系里充分水化和扩展，在第三步再加入SDS高温孵育，之后冷却至室温进行提取。
第四步：离心，参数为最大相对离心力16,000 g，离心10分钟，取上清，就达到分离的目的了。
石蜡包埋样品提取的效率通常是，一平方毫米样品可提取一微克蛋白，大家可以通过这个效率值对样品中能提取的蛋白进行估算。
**植物组织样品
**
对于植物组织样品，难点就在于细胞壁及叶绿素的去除。
第一步：充分再充分地研磨。由于细胞壁十分强壮，所以一定要好好地研磨，充分碎裂。一般的匀浆根本搞不定细胞壁，没办法碎得充分。
第二步：去色素。可以通过有机溶剂多次反复沉淀样品来去除色素，比如丙酮、TCA（三氯乙酸）、甲醇，一次一次地清洗前面研磨成粉的样品，这样可以把叶绿素去掉。
第三步，离心取沉淀，然后加入裂解液，让蛋白充分地溶解。
第四步：进行蛋白质的抽提。在抽提的过程中，要看细胞的破碎程度或者样品的类型，叶片样品相对来说比较简单，茎的样品比较麻烦，它的纤维组织比较大，再加上植物细胞壁又比较厚，所以我们得用超声、震荡，以及各种方法组合，进行蛋白质的抽提。
第五步：离心取上清，就得到了蛋白溶液。
根据以往经验，像叶片这类的样品，处理起来比较简单，例如水稻的叶片组织提取出来可以做到8000多个蛋白；根的样品稍微麻烦一点，因为含水量特别多，先得烘干，尽量去掉它的水份，干燥后再进行研磨提取。否则，我们可能会加入很多根，但其实能提取的样品并没有多少。花的组织，比如桃花、梨花，也是水分太多的问题，需要先干燥。种子组织，例如花生，在破碎成粉后，也需要多次使用有机溶剂去掉它的脂肪。
总之，根、茎、叶、果实等，根据不同的样品类型，我们需要根据它的特点设计不用的处理步骤，简单来说，就是通过有机试剂去掉它的色素和脂肪组织，水分太多的先烘干再提取，常规情况就是研磨和去色素。大家清楚了各种处理的用处之后，就可以针对自己的样品灵活地处理了。比如棉花样品，因为它纤维特别多，你可能就会想到得通过研磨和反复沉淀来进行纯化，再进行后续分析。
**细菌样品
**
与植物样品类似，细菌样品的细胞壁也是我们提取蛋白的最大障碍，尤其是像革兰氏阳性菌，以及一些细菌的亚型，细胞壁特别厚，破碎的时候需要更强的参数，更长的时间。
刘晓慧老师分享了两个她遇到的例子：有一次做细菌样品，不巧它就是一个细胞壁特别厚的亚类，最开始采用急热骤冷，即从-80℃冰箱取出，95℃煮1分钟，反复几次，然后超声，但是提出来的蛋白量特别少。最后还是用了液氮研磨的方法，研磨之后再加入裂解液，才提取出大量的蛋白。所以，对于细菌的样品，我们可以尝试多种方法，测试一下。
还有一次做酵母样品，在做超声的时候，因为有点事情离开了，所以超声的时间就特别长，并且几次超声之间做了急热骤冷处理。另一位同事使用同样的方法，只是超声时间比较短。最后发现超声时间长的样品，破碎地非常好，显微镜下看到的都是酵母的碎片，提取到的蛋白也很多，而超声时间短的提取到的蛋白就少很多。所以我们在碎裂样品时，也可以多尝试几种方法，几种参数。
体液样品
体液样品难点在于高丰度蛋白的去除。以血清为例，前14种高丰度蛋白占血清总蛋白的95%以上。而质谱是一种离子饱和性检测器，低丰度离子的信号很容易被高丰度的抑制，从而无法检测到。
我们有很多办法去掉高丰度蛋白。当然，有些情况下，为了保证样品的完整性，也有人不去除高丰度蛋白，这个视具体情况而定。另外，高丰度蛋白可能还会与一些低丰度蛋白相结合，当我们去掉高丰度蛋白时，往往就会将这些有意义的低丰度蛋白也去掉，无法保证分析的完整性。针对这种情况，用普通的shotgun方法是很难解决的，后面我们会介绍一种方法，它在高丰度蛋白存在的情况下，仍然可以稳定地可重复地鉴定到很多中低丰度的蛋白。
要去除高丰度蛋白，很多商业试剂盒都可以帮到我们。它们的原理各有不同，我们来看几个比较常用的。
第一种是Bio-Rad的Proteominer试剂盒。
这类试剂盒的原理是：通过一个六肽配基与高丰度蛋白结合，从而进行去除。这种方法是非抗体型的，没啥特异性，它不受物种限制和样品类型限制。当样品进来时，六肽配基会优先结合丰度高的蛋白质，丰度低的嘛，结合的机会小很多，于是就达到了分离去除的目的。
通过这个办法处理后，最终能鉴定到的蛋白也是比较多的，从鉴定的数量上看，与安捷伦的特异性试剂盒差不多。但如果要发高分的文章，用这种方法容易受到质疑，也是因为它的特异性不强，去高丰度有一定的随机性，高分杂志不太接受这种随机的方法。但如果你的样品体积特别大，可以先试着用Proteominer做一次，接下来再使用一些特异性的去高丰度蛋白的方法。或者你的样品没有特异性抗体柱可以用的话，也可以考虑这种方法。
第二种是安捷伦的MARS柱。它含有14种蛋白抗体，针对血清中的高丰度蛋白能很有针对性地去除，需要的样品量通常为20μL-40μL，20μL的血清样品可以得到约100微克的蛋白样品，40μL的量足够我们做一次iTRAQ或label free实验了。
第三种试剂盒是Thermo的Pierce Albumin/IgG的试剂盒，可以去两个高丰度蛋白。现在出了一个去20个高丰度蛋白的试剂盒，这是基于抗体方法，针对性很强，是比较公认的方法。
第四种是SIGMA公司的Human IgY14 and SuperMix Columns，2015年MCP上发表了一篇文献，里面用到这个试剂盒，先是用特异性柱子去掉14个高丰度蛋白，然后再特异性去掉50个中丰度的蛋白，最后可以鉴定到5300多个血清蛋白质。对比现在常规的方法，通常只能鉴定到500-600个血清蛋白，如果高丰度蛋白去除得比较好，用QE的方法做，也只能鉴定到1000个左右蛋白。这篇文章鉴定出了5300个蛋白质，在血清样品的蛋白鉴定中确实是一个相当outstanding的结果了。
以上是四种比较常用的去高丰度的试用盒。总的来说，针对像尿液这类体积很大的样品，可以用Proteominer的方法，因为其余的基于抗体的方法都对蛋白含量有所要求。去掉高丰度蛋白后，我们可以对尿液先进行浓缩，使它的浓度达到50μg/μL或更高，再进行后续的蛋白提取，效果会更好。另外，尿液样品也可以通过沉淀的方法对蛋白进行提取。
另外，像脑脊液样品，也可以通过Proteominer方法进行提取，它的蛋白含量也比较低。刘晓慧老师组尝试过用安捷伦的特异性去除14个高丰度蛋白的试剂盒与Proteominer的随机去除6个高丰度蛋白试剂盒进行比较，最后能检测到的蛋白结果都差不多。
**亚细胞器蛋白质提取
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针对亚细胞器的提取，我们分几步来完成：
第一步：对组织或细胞进行匀浆，不需要匀得非常碎，通常匀个10-20下就可以了；
第二步：初步分离，使用差速离心的方法，具体说明见上图。
第三步：用蔗糖密度梯度离心进行再分离。蔗糖密度梯度是连续的，那么相应的亚细胞器会在等密度的蔗糖密度区间内沉积。于是，可以将溶酶体、线粒体，以及其它微体分开。然后取出对应的细胞器，再进行裂解和提取。
Tips：蔗糖密度梯度离心需要使用超速离心机，平衡及各方面控制都需要比较精准，所以操作时特别需要小心。
第四步：对亚细胞器进行验证。这一步需要引入Western，比如用到一些线粒体特异的抗体，或者细胞膜、细胞核特异的抗体，进行样品纯度的确证，之后再进行后续的实验。否则，如果样品中有污染，会给后续的实验带来很难解释的问题。
针对不同样品的蛋白提取方法，今天小编就分享到这里。大家如果有什么问题，欢迎留言提问交流~ 下一篇小编将继续分享样品前处理的余下几步，即蛋白提取的质量控制、脱盐、还原烷基化和酶解，敬请期待哦~
