表达定量
1. 处理原始比对文件
- 利用 picard / samtools
- 将 sam 格式转换为 bam 格式
- 对 bam 文件进行排序
- 去除比对得分较低的序列
- 如果需要，可以去除重复 reads
2. STAR + RSEM （先比对，再定量，耗时长）
- 输出结果可以选择转录本定量或者基因定量
- 定量单位包括 feature count, FPKM, TPM
- 操作相对复杂
3. STAR + HTSeq （先比对，再定量，耗时长）
- 输出结果为原始 read count
- 结果可用于差异表达分析
- 操作相对简单
#htseq-count
htseq-count -r pos -m union -f bam -s no \
-q 03align_out/sample2Aligned.sortedByCoord.out.bam > 05htseq_out/sample2.htseq.out
4. Kallisto (free-alignment) （只定量，不比对）
- 速度快，省内存
- 基于转录本定量
- 不产生 bam 文件，不方便其他后续分析
5. STAR + RSEM 实例演示
- 准备定量分析所需文件
# rsem prepare reference：建立参照基因组
rsem-prepare-reference --gtf 00ref/Araport11_GFF3_genes_transposons.201606.gtf \
00ref/TAIR10_Chr.all.fasta \
arab_RSEM/arab_rsem
- 利用STAR结果进行分析定量
rsem-calculate-expression --paired-end --no-bam-output \
--alignments -p 5 \
-q 03align_out/sample2Aligned.toTranscriptome.out.bam \
arab_RSEM/arab_rsem \
04rsem_out/sample2_rsem
6. Kallisto 演示
- 利用转录本参考序列文件构建索引
mkdir arab_kallisto
cd arab_kallisto
kallisto index -i arab_kallisto ../arab_RSEM/arab_rsem.transcripts.fa
kallisto运行结果：产生了54.4 million 个k-mer
- 进行无比对定量分析
#定量：quant: 定量模式；-i：index文件；-o：输出文件
kallisto quant -i arab_kallisto/arab_kallisto -o 05kallisto_out/sample2 \
02clean_data/sample2_paired_clean_R1.fastq.gz 02clean_data/sample2_paired_clean_R2.fastq.gz #输入文件，即原始数据，不需bam格式
运行结果
