三十六策 第 11 策 见微知著
miRNA 研究的优势
第一，miRNA 是非编码 RNA，没有蛋白 表达差异、验证基因过表达还是沉默的效率，只需要 qPCR 验证
第二，miRNA 是短片段，直接合成就行，转染效率高，不需要用病毒载体
第三，探索分子机制，miRNA 有一套固定的机制模式：miRNA一般作用于靶基因的 3’-UTR 引起下游靶基因表达沉默 荧光素酶报告基因实验
已知 miRNA 预测它的靶基因→有现成的数据库
miRNA 的规范化套路
miRNA 第一个特征是长度整齐划一，都是 19-25 核苷酸的单链 RNA 片段，在物种之间保守性比较好，突变的概率小。
成熟的miRNA分子可以跟一个或多个mRNA分子不完全匹配的互补结合，一旦结合上就可以下调基因的表达。miRNA主要作用位点在靶基因的3’-UTR，依赖于RISC沉默复合体发挥作用
查询 miRNA 的权威数据库是 miRBase
现在的 miRNA 命名，起头先用物种名称，如人的是 hsa，小鼠是 Mmu，大鼠是 Rno ，物种后面加一个横杠接 miRNA 简写成 miR/mir，再加个横杠接序号数字。
如果遇到新发现的 miRNA 跟已有名称的高度同源的情况，序列只差 1-2 个碱基，区分开来没法体现这种序列和功能上的相似性，那就在第一个发现的 miRNA 后加上小写的 a/b/c 这样区分。
如果一条 miRNA 可以来源于不同的 DNA 编码区域，也就是在基因组有平行的多个拷贝，那么还要在 a/b/c 后面加个横杠再以数字 1/2/3 来表示。
物种-miR-数字序号+字母-5p/3p
功能基因 5 步法研究套路:
1)检测基础表达水平;2)制备分子操作工具;3)细胞功能表型实验;4)动物水平表型验证;5)Rescue 实验。
先筛、猜分子，在五步法里完成前面三步就已经得到了细胞水平的表型结果，过表达加沉默一正一反的双向研究， 在找候选分子的时候只要先做一个方向就行了，在疾病中高表达的分子做沉默验证，低表达的分子做过表达，目标是抑制或者缓解致病的表型。
套路执行的第一步还是分析 miRNA的表达差异情况，包括细胞和组织水平的检测。
蛋白可以做免疫组化、免疫荧光，miRNA 只需要做 RNA 水平用实时定量 PCR(Real-time PCR)来验证就行了。
第二步是制备 miRNA 过表达或者抑制的实验工具，这一步基本等同于做 RNA 干扰时候合成 siRNA 片段。
miRNA 过表达有个专用名词叫 mimics(模拟物)
miRNA 的沉默叫 inhibitor(抑制物)
用定量 PCR 来检测一下，这一步也不需要 Western
第三步细胞表型验证，同样研究一个表型，模型一样、Assay 一样、Biomarker 一样往里套就好了。
找 miRNA 的靶基因
机制(Mechanism)
解释一个分子介导某种表型背后的原因就是分子机制
变量分子和通路组合在一起，通路就是解释分子发挥功能的机制
药物和分子组合在一起，分子就是解释药物为什么有效的机制
药物也可以跟通路串联在一起，用通路变化来解释药物起效的机制
机制研究的两个层次：知其然不知其所以然 和 知其然知其所以然。
知其然不知其所以然是间接作用机制，是分子机制的初级层次，知道了主变量通过影响下游另外一个因变量发挥功能，但是他们之间具体怎么调节的，不清楚，仅仅解答了 Why 的问题。
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知其然知其所以然是直接作用机制，是分子机制的高级层次，不但知道有调控关系，而且知道直接作用的靶点和方式是什么。在 Why 的问题基础上，How 的问题也有了解释。
miRNA 靶向作用于下游一个编码基因，是最简单的一种机制模型
miRNA 为主变量的研究项目只要有分子机制一般就是做靶基因，这是一种直接作用机制
在预测 miRNA 靶基因方面最权威的数据库是 Targetscan
实验验证是不是潜在靶基因，只需要在细胞株中过表达 miRNA 然后 qPCR，WB 检测一下，选出 miRNA 过表达以后表达下调的预测靶点。找到这种有显著负调节关系的预测靶基因后再加一个 Luciferase assay，就可以证明直接调控作用了。
荧光素酶报告基因实验：用在 miRNA 靶基因验证；在研究转录因子对启动子的调控活性
阻遏翻译和引导 mRNA 降解是两种机制，一个 miRNA 过表达，其靶基因 mRNA 可能表达降低，也可能变化不显著，但在蛋白水平应 该表现为明显的降低，
总结
功能基因研究五步法基础上，往里换一个miRNA分子，整体数据框架是一致的。前面四步miRNA的套路跟功能基因一样，只是操作细节略有区别，总体而言miRNA实验比蛋白更好做。第五步Rescue跟前面套路不太一样，单变量的Rescue，只适合功能基因，不太适合非编码RNA。而且我们已经提出了miRNA的靶基因验证，那么Rescue也不再是单变量的Rescue了，而是上下游具有调控关系的分子间的rescue验证策略。
