构建tPD-L1 KO的肿瘤细胞系[CRISPR/Cas9]：

1.病毒构建

2.肿瘤细胞与病毒颗粒在12孔板中共培养（5x10^5 细胞/孔），直到细胞达到30-50%的confluence：                                                                                                                           2.1 加入稀释液[2.5ml 50% OPTI-MEM+50% DMEM]，37℃过夜                                       2.2 将基质液吸引掉，加入混合液[0.5ml 病毒溶液+0.5ml RPMI+0.6ul 凝聚胺polybrene]，混合，37℃，48-60h                                                                                         2.3 收集细胞到10-cm dish中，培养。加入嘌呤霉素puromycin(5ug/ml) 3天[筛选转染成功的细胞]

3.30ng/ml mIFNγ刺激过夜[IFNγ刺激PD-L1表达]

4.BD流式分选

a defined in vitro CTL-tumorinteraction system：

2/20 CTL——4T1 or CT26

2/20 CTL细胞系不需要从naive状态分化

2种肺转移模型：

1.4T1自发肺转移模型

2.实验肺转移模型

methylcholanthrene，MCA 甲基胆蒽诱导肿瘤形成：

小鼠皮下注射100ug甲基胆蒽

3个月后可取肿瘤

BMDM(Bone marrow-derived macrophage) generation and treatment:

1.取小鼠股骨、胫骨，置于70%乙醇中消毒10min，后用PBS冲洗

2.用RPMI(1640)冲洗骨髓腔

3.将骨髓细胞混合液制成单细胞悬液：过100uM滤网，裂红

4.将5×10^6骨髓细胞置于10cm细胞培养皿(culture dish)中，皿中为完全培养基+50ng/ml mM-CSF。培养第三天更换新的培养基

5.第6-7天，收集巨噬细胞至PBD+1mM EDTA中

6.流式检测纯度[CD45+CD11b+F4/80+]

髓系细胞清除实验：

有研究证明：氯磷酸盐脂质体能够通过清除巨噬细胞、髓系细胞促进肺转移