操作步骤 (请自行准备无水乙醇、异丙醇、灭菌 1.5mL 离心管) :
1. 取出洗涤液,按以下操作:
a) 洗涤液 A:21mL 加入 9mL 无水乙醇;42mL 加入 18mL 无水乙醇,混匀。
b) 洗涤液 B:18mL 加入 42mL 无水乙醇;36mL 加入 84mL 无水乙醇,混匀。
c) 配制好的洗涤液如出现沉淀,可在 37℃溶解,摇匀后使用。
2. 取 1.5ml 离心管,放入 5x5x5mm 大小的凝血块,用枪头反复敲打挤压至 1x1x1mm 大小,加入 200 μL 裂解液、3μLDNACarrier 和 40μL消化液,涡旋强烈振荡 30 秒,65℃温育 20 分钟至血凝块完全消解。
3. 加入 450μL 异丙醇,混合均匀,如有半透明悬浮物,不影响 DNA 的提取与后续实验。
4. 将吸附柱放入收集管内,将上述溶液转入吸附柱内,12,000 rpm 离心 1 分钟,弃收集管内废液;
5. 将吸附柱放回收集管内,加 500μL 洗涤液 A 至吸附柱内,静置 1 分钟,12,000 rpm 离心 1 分钟,弃收集管内废液。
6. 将吸附柱放回收集管内,加 500μL 洗涤液 B 至吸附柱内,静置 1 分钟,12,000 rpm 离心 1 分钟,弃收集管内废液。
7. 将吸附柱放回收集管内,加 500μL 洗涤液 B 至吸附柱内,12,000 rpm 离心 1 分钟,弃收集管内废液。
8. 按每份样本 40μL 取洗脱液(如 10 份提取样本,即取 400μL 洗脱液),放置于灭菌 1.5mL 离心管,65℃预热。
9. 将吸附柱放回收集管内,12,000 rpm 离心 2 分钟,离去残留的洗涤液。
10. 取出吸附柱,放入新的 1.5 mL 灭菌离心管内,在吸附柱中心加入 40 μL 预热洗脱液,静置 2 分钟,12,000 rpm 离心 1 分钟,收集 DNA溶液。提取的 DNA 即可用于下一步实验或-20℃保存。
注意事项:
1. 裂解液、洗涤液含有刺激性化学物质,操作过程请做好防护措施,避免直接接触皮肤,防止吸入口鼻。如不慎沾染皮肤或眼睛,请立即用清水或生理盐水冲洗,必要时请就医。
2. 洗涤液在使用前应加入无水乙醇后充分混匀。