在高通量测序当中，很重要的一块就是检测基因的表达量，它是差异分析和转录组数据分析的基础。与q-PCR相似，基因表达量的衡量也是采取相对定量的方法。
落在一个基因区域内的read counts数目取决于基因长度和测序深度。
1.基因长度的影响
在同一个样本中，基因越长，随机打断得到的片段就越多，该基因被测到的概率就越大，比对到该基因的reads就越多。
2.测序深度的影响
不同样本里，样本的测序深度越高，同一基因被测到的次数越多，比对到该基因的reads数就越多。
由1和2可知一个基因越长，测序深度越高，落在其内部的read counts数目就会相对越多。因此我们想比较不同基因的表达量，就要进行数据标准化。
看上图，rep3和rep相比，无论哪一个基因，rep3的计数都高于rep1，说明rep3的测序深度高于rep1；而基因B与基因A相比，无论在哪一个rep里，基因B的计数都高于基因A，说明基因B的长度大于基因A。
RPKM
RPKM：Reads Per Kilobase Million
先将测序深度标准化，然后将基因长度标准化。
计算公式：RPKM= total exon reads/(mapped reads(millions) x exon length(KB))
total exon reads:某个样本mapping到特定基因外显子上所有的reads.
mapped reads(millions):某个样本所有的reads总和.
exon length(KB):某个基因的长度（外显子长度总和，以KB为单位）.
如上图所示，Rep1 RPKM=10/(35x2)=1.43
FPKM
FPKM：Fragments Per Kilobase Million
RPKM is for single end RNA-seq.
FPKM is very similar to RPKM, but for paired end RNA-seq.
看下图理解reads和fragment的区别，以及为何RPKM for SE and FPKM for PE.
对于PE，如果一对paired-read都比对上了，那么这一对pair-read称为一个fragment；如果一个比对上了，另一个没比对上，那么这个比对上的read就称为一个fragment。
TPM
TPM: Transcripts Per Kilobase of exon model per Million mapped reads (每千个碱基的转录每百万映射读取的Transcripts)
TPM和RPKM以及FPKM最主要的区别：different order.
TPM先将基因长度标准化，然后将测序深度标准化
TPM顺序：
可以看出TPM是先对基因长度标准化，再对测序深度标准化，这与FPKM正好相反。
个人理解：由于标准化顺序的不同，导致TPM的pie是一样的，而RPKM的pie是不一样的。
statquest：with TPM, everyone gets the same sized pie. since RNA-seq is all about comparing relative proportions of reads, this metric seems more appropriate.
