文章信息
发表杂志名称：Theranostics
中文标题：解析单细胞图谱揭示 RNA m6A 修饰在动脉粥样硬化中细胞类型特异性的功能作用
英文标题：Deciphering single-cell landscape unravels cell-type-specific functional roles of RNA m6A modification in atherosclerosis
影响因子：12.4
发表日期：2025.03.29
研究概述
动脉粥样硬化是全球主要致死病因之一，m6A 修饰在其中的调控机制在单细胞水平尚不清楚。本研究分析动脉粥样硬化患者单细胞测序数据，发现 m6A 调节因子在不同细胞类型中有特异性表达模式，如 ALKBH5、WTAP、METTL3 和 YTHDF2 分别在血管内皮细胞（ECs）、平滑肌细胞（SMCs）和巨噬细胞中发挥不同调控作用，还揭示了相关转录因子及 m6A 调节因子在细胞间通讯中的作用，为动脉粥样硬化的精准治疗提供了潜在靶点。
研究结果
m6A 调节因子在动脉粥样硬化细胞类型中的表达谱（图 1）：
作者从 GEO 数据库获取 11756 个动脉粥样硬化冠状动脉细胞的 scRNA-seq 表达数据，经质控后对 11722 个细胞进行分析。通过 t-SNE 降维并基于已知标记基因手动注释分类出 20 个主要细胞簇（图 1A）。多数 m6A 调节因子在各细胞类型中广泛分布，但不同细胞类型中其表达水平存在差异，如 IGF2BP3 在巨噬细胞中表达最高（图 1B、1C）。基于所有基因和 m6A 调节因子表达的聚类分析表明，细胞类型并非依据 m6A 调节因子表达聚类，而是基于所有基因表达聚类，这意味着 m6A 调节因子在动脉粥样硬化细胞类型中可能具有相似调控机制（图 1E）。m6A 调节因子与各细胞类型标记基因无重叠，说明其不作为标记基因发挥潜在调控功能（图 1F）。此外，作者通过相关性分析发现 m6A 调节因子评分与 “细胞间粘附” 和 “心脏发育中涉及的细胞表面受体信号通路” 等显著相关，且同一 m6A 调节因子在不同细胞类型中可能有相似或相反调控作用（图 1G）。综上所述，m6A 调节因子在动脉粥样硬化不同细胞类型中表达有差异，且与多种生物学功能相关，具有细胞类型特异性的调控作用。
ALKBH5 调节 EC 增殖和迁移参与发芽血管生成（图 2）：
作者分析 m6A 调节因子表达与关键通路的相关性，发现 ALKBH5 与 ECs 中的通路呈显著正相关，涉及 EC 增殖、迁移及发芽血管生成（图 2A、2B）。进一步聚焦相关通路基因，发现 ALKBH5 与这些基因也呈显著正相关（图 S2A）。将 ECs 按 ALKBH5 表达分为两组后，发现 NRP1、FGF2 等多个基因在 ALKBH5 高表达组高表达（图 2C）。差异表达分析显示，ALKBH5 高表达组在发芽血管生成过程中与细胞迁移和增殖相关的通路更活跃（图 2D、2E） 。通过 WGCNA 分析，作者鉴定出与 ALKBH5 共表达的基因模块，其中绿松石模块基因功能富集于血管生成和细胞迁移（图 2F - 2H）。利用 SCENIC 预测发现 ALKBH5 受 CTCF、MYC 和 JUN 等转录因子调控（图 2I）。总之，ALKBH5 在 ECs 中与发芽血管生成相关通路及基因密切相关，且受多种转录因子调控，对 EC 增殖和迁移有重要调节作用。
ALKBH5 在激活 EC 表型变化和促进 EC 细胞间通讯中的潜在作用（图 3）：
为探究 ALKBH5 对 ECs 细胞间通讯的影响，作者比较了 ALKBH5 高、低表达组的网络差异（图 3A、3B）。分析多个信号通路发现，在 ALKBH5 高表达组中，与内皮表型激活相关的 LAMININ、CXCL 等通路以及与细胞外基质和血管生成相关的通路更活跃（图 3C、3D） 。同时，ECs 与免疫细胞、周细胞和 SMCs 等的通讯存在差异，主要通过 COL4A1 - CD44 等配体 - 受体对相互作用（图 3E、3F）。而且，ALKBH5 高表达组中相关配体和受体基因表达显著升高，且与 ALKBH5 呈显著正相关（图 3G、3H）。由此可见，ALKBH5 可能通过促进血管生成、细胞迁移和粘附来激活 EC 表型，进而影响疾病进展。
HCAECs 中 ALKBH5 上调驱动 ox - LDL 诱导的血管生成，敲低可逆转该效应（图 4）：
作者用 ox - LDL 和 IL - 1β 刺激人冠状动脉内皮细胞（HCAECs），发现 ALKBH5 表达显著增加，m6A 甲基化水平下降（图 4A - 4D）。敲低 ALKBH5 后，m6A 甲基化增加，且 ox - LDL 诱导的 HCAECs 增殖、迁移和血管生成能力增强的效应被逆转（图 4E - 4L）。生物信息学分析及实验验证表明，ALKBH5 影响 NRP1、FGF2 等基因表达，且 KLF2 和 PLK2 的 m6A 修饰受 ALKBH5 调控（图 S4G - S4I）。此外，敲低 ALKBH5 不影响其上游转录因子 CTCF、MYC 和 JUN 的表达（图 S4J - S4K）。这表明 ALKBH5 在 ox - LDL 诱导的 HCAECs 血管生成中起重要作用，敲低 ALKBH5 可通过影响相关基因的 m6A 修饰来逆转 ox - LDL 的诱导效应。
WTAP 表达上调通过促进 SMCs 细胞增殖和迁移增加斑块不稳定性（图 5）：
作者对 m6A 调节因子在 SMCs 中的调控作用进行相关性分析，发现 WTAP 与细胞迁移、增殖和血管生成等通路显著正相关，且与 SMCs 增殖和迁移相关基因也显著相关（图 5A、5B）。将细胞按 WTAP 表达分组后，发现 WTAP 高表达组中 NR4A3 和 PRKG1 等相关基因表达更高（图 5C）。差异表达分析和功能富集分析显示，WTAP 高表达组中与 SMCs 增殖和迁移相关的通路更活跃（图 5D - 5F）。通过 hdWGCNA 分析，鉴定出与 WTAP 共表达的基因模块，其中绿松石模块基因功能与 SMCs 增殖和迁移相关（图 5G - 5K）。利用 SCENIC 预测发现 WTAP 受 MEF2C、FOS 和 ATF3 等转录因子调控（图 5L）。综上，WTAP 在 SMCs 中与增殖和迁移相关通路及基因密切相关，受多种转录因子调控，对 SMCs 增殖和迁移有重要调节作用，其上调可能增加斑块不稳定性。
WTAP 是 SMCs 表型转化的重要调节因子（图 6）：
作者对 SMCs 进行重新聚类，得到两个亚群 SMC1 和 SMC2（图 6A）。伪时间轨迹分析显示存在从 SMC1 到 SMC2 的潜在转化轨迹（图 6B、6C），且 WTAP 表达和 “表型转换” 通路的特征评分在 SMC2 中更显著（图 6D）。通过热图可视化基因动态变化并进行 GO 富集分析，发现 SMC2 可能代表具有增殖和迁移能力的合成表型亚群（图 6E）。两个亚群的代表性功能通路与 WTAP 的相关性相反，且相关基因在伪时间轨迹上表达模式不同（图 6F - 6I）。这表明 WTAP 参与了动脉粥样硬化中 SMCs 的表型转化过程。
METTL3 和 YTHDF2 调节巨噬细胞激活和分化从而促进动脉粥样硬化（图 7）：
作者通过相关性分析发现 METTL3 和 YTHDF2 与巨噬细胞分化、增殖、激活和趋化等通路显著相关（图 7A、7B）。分别按二者表达水平分组后，发现 METTL3 高表达组和 YTHDF2 高表达组中 TRIB1、RB1 等多个重要基因表达更高（图 S8A）。差异表达分析和功能富集分析显示，METTL3 高表达组中与巨噬细胞分化和激活相关的通路显著富集，YTHDF2 高表达组中 “巨噬细胞分化” 通路富集（图 7C - 7E，图 S8B - S8D）。利用 hdWGCNA 分析鉴定出与 METTL3 共表达的绿色模块，其基因功能与炎症反应和细胞因子相关（图 7F，图 S8E）。通过 SCENIC 预测发现多个转录因子调节 METTL3 和 YTHDF2，如 IRF1、YY1 等（图 7H）。综上所述，METTL3 和 YTHDF2 在巨噬细胞中与激活和分化相关通路及基因密切相关，受多种转录因子调控，对巨噬细胞功能有重要调节作用，可能促进动脉粥样硬化发展。
作者比较 METTL3 高、低表达组巨噬细胞的细胞间通讯，发现 METTL3 高表达组巨噬细胞与其他几种细胞类型间的通讯相对较少，但 TNF、CD40 等与细胞间粘附和炎症因子分泌相关的通路更活跃（图 7I - 7K）。进一步分析发现巨噬细胞与多种细胞类型的相互作用广泛，主要通过 TNF - TNFRSF1B 等配体 - 受体对介导（图 7L）。同时，METTL3 与相关配体和受体基因呈显著正相关，且这些基因在 METTL3 高表达组表达显著升高（图 7M，图 S9E - S9G）。类似地，YTHDF2 高表达组巨噬细胞信号强度增强，CXCL 和 ITGB2 等通路更活跃，相关配体 - 受体对介导了巨噬细胞与 ECs 等细胞的相互作用，且 YTHDF2 与这些配体和受体基因呈显著正相关（图 S10A - S10J）。这表明 METTL3 和 YTHDF2 可通过调节粘附和炎症功能影响巨噬细胞与其他细胞的相互作用，进而影响动脉粥样硬化进程。
本研究通过分析动脉粥样硬化患者单细胞测序数据，全面探究了 m6A 修饰在关键细胞类型（ECs、SMCs、巨噬细胞）中的调控机制。发现 m6A 调节因子在不同细胞类型中有特异性表达模式，ALKBH5 在 ECs 中促进增殖、迁移和血管生成，WTAP 在 SMCs 中促进增殖、迁移和表型转化，METTL3 和 YTHDF2 在巨噬细胞中促进激活和分化，还揭示了相关转录因子对 m6A 调节因子的调控作用以及 m6A 调节因子在细胞间通讯中的作用。这些发现为动脉粥样硬化的病理机制提供了新见解，也为其精准治疗提供了潜在靶点。
