瑞典卡罗林斯卡医学院诺贝尔奖委员会宣布，匈牙利科学家卡塔林·卡里科（Katalin Karikó）和美国科学家德鲁·韦斯曼（Drew Weissman）荣膺2023年诺贝尔生理学或医学奖，以表彰他们在核苷碱基修饰方面的发现，这些发现使针对新冠感染的有效信使核糖核酸（mRNA）疫苗的开发成为可能。
1. 背景
新冠病毒是一种传染性极强的单链RNA病毒，在全球范围内迅速传播。由此产生的感染被称为2019冠状病毒病（新冠肺炎），可导致多种症状，如咳嗽、发烧、胸部不适，严重时甚至呼吸窘迫综合征。截至2023年9月27日，全球共有770,875,433例新冠肺炎确诊病例，6,959,316名患者死于病毒感染或其他相关并发症。有效和安全的疫苗对于控制新冠肺炎大流行至关重要。世界卫生组织对已分析或批准进行临床试验的COVID 19疫苗进行分类分为以下几类：灭活疫苗、减毒活疫苗、载体、RNA、DNA、蛋白质亚单位和病毒样颗粒（VLP）疫苗[1]。
mRNA疫苗凭借着其设计与制造的简便性、低免疫原性、快速量产性在疫苗市场占据的半壁江山。其中代表性疫苗是——美国FDA于2021年8月23日和2022年1月31日完全批准了两款新冠疫苗，分别是辉瑞/BioNTech合作开发的Comirnaty（BNT162b2）与Moderna公司开发的Spikevax（mRNA-1273）。以Comirnaty为例，BNT162b2是一种以脂质纳米颗粒为载体的核苷修饰mRNA疫苗，用于预防新冠感染引起的新冠肺炎。BNT162b2编码冠状病毒2型刺突蛋白，并且表达在受体中，引发针对抗原的免疫反应。2020年12月初，这款疫苗在英国获得了临时紧急使用授权（EUA），随后在巴林、加拿大、墨西哥、沙特阿拉伯和美国获得了一系列紧急使用批准或授权。不久之后，BNT162b2在瑞士（2020年12月19日）和欧盟（2020年11月21日）获得有条件上市授权，用于积极免疫接种，以预防16岁及以上人群因SARS-CoV-2引起的新冠肺炎[2]。
2. mRNA疫苗的发展史
2.1 mRNA疫苗的贡献者
在1978年，科学家用名为“脂质体”的脂质膜结构将mRNA转运到小鼠和人类细胞内诱导蛋白质表达。这种脂质体能包裹并保护mRNA，之后与细胞膜融合，将这种遗传物质送入细胞。但在当时，研究人员还没有把mRNA当作医疗产品看待，因为大部分研究使用的mRNA都是动物来源的，换言之，并不能根据临床需求，随心所欲的设计基因序列。
事情在1984年出现了转机。当时，哈佛大学的Krieg和Douglas Melton利用一种来自于病毒的RNA合成酶和其他工具在实验室得到了具有生物活性的mRNA[3]。值得一提的是，这项技术的核心沿用至今——SP6 RNA聚合酶是一种由酵母菌SP6病毒基因组中的SP6基因编码的酶，它是一种DNA依赖的RNA聚合酶，能够将DNA模板转录成RNA。随后，Krieg将实验室合成的mRNA注射到青蛙卵子中，证明它和真的没两样[4]。之后的研究中，Melton发现这种合成mRNA能激活或抑制蛋白产生，他便创立了一家名为Oligogen的公司专门研究合成RNA抑制目标基因表达的方法，寻找治病的可能。但他们并没有料想到mRNA可以成为预防性的疫苗。
多年后，Malon受到前人的启发，与脂质体生物化学家Philip Felgner合作，利用LNP作为递送载体，将mRNA递送至机体内。这种脂质体带一个强正电荷，通过静电作用结合与带负电的mRNA骨架。他们与合作者证明了这种脂质-mRNA复合物可以促进小鼠体内的蛋白产生。之后两人致力于开发一款基于mRNA的流感疫苗，但因为生产成本和可行性的问题，这个项目一直举步维艰。
在疫苗的开发过程中，科学家们得到了很多激动人心的发现。1993年，Pierre Meulien在首次证明了包在脂质体中的mRNA能在小鼠体内诱导出一种特异性的抗病毒免疫应答。在这篇文章中用含有编码流感病毒核蛋白（NP）的信使RNA（mRNA）的脂质体免疫小鼠，在体内诱导抗流感细胞毒性T淋巴细胞（CTL）。诱导的CTL在特异性方面与用感染性病毒在体内获得的CTL相同。此外，使用相同的mRNA-LNP复合体，在三种不同单倍型的小鼠中也可以引发相同的病毒特异性CTL反应。
另一个激动人心的进展出现在1992年，基因突变的大鼠无法正常表达和分泌血管加压素从而导致尿崩症。当时美国斯克里普斯研究所（Scripps Research Institute）的科学家在下丘脑中注射来自正常大鼠下丘脑的纯化信使核糖核酸。注射后数小时内可观察到尿崩症的暂时逆转（长达5天）。在某种程度上，这个实验证明了mRNA可以治疗像尿崩症这样的代谢疾病。
因为mRNA的疫苗存在着易降解，生产成本太高，容易引发强烈炎症反应等问题。几乎所有的mRNA疫苗公司都把目光投入到了肿瘤治疗上。这里的思路是：如果mRNA能编码癌细胞表达的蛋白，那么把mRNA注射到体内就可以训练免疫系统去攻击这些细胞。目前就职于华盛顿大学医学院的Curiel就在小鼠上成功完成了测试。他们构建了编码荧光素酶和人癌胚抗原（CEA）的mRNA转录物，脂质体介导转染后，编码人CEA的mRNA构建体在体外小鼠成纤维细胞中定向表达CEA。体内注射后，编码萤光素酶的mRNA转录产物介导萤光素酶表达。基于蛋白质在体外和体内表达的证明，检验了使用这种载体作为肿瘤疫苗的可行性[5]。
相比之下，另一位癌症免疫学家Eli Gilboa取得了更多成功。EliGilboa的思路是从血液中获得免疫细胞，“唆使”它们吸收编码肿瘤蛋白的合成mRNA，再将这些细胞注射到体内，调动免疫系统攻击潜伏的肿瘤。Gilboa和他在美国杜克大学医学院的团队在小鼠中演示了以上过程[6]。
2.2 脂质体递送系统的贡献者
说到关键技术，许多专家还提到了对mRNA疫苗至关重要的另一项创新成果——脂质纳米粒（LNP），这种微笑的脂滴能保护mRNA并将其送入细胞。这项技术来自Pieter Cullis的实验室和他创立或管理的多家公司。其中一种药物叫Patisiran（Onpattro），帕替西伦现已被批准用于治疗一种罕见遗传病——遗传性转甲状腺素蛋白(hATTR)淀粉样变性。发病机制：遗传性转甲状腺素蛋白(hATTR)淀粉样变性是一种由转甲状腺素蛋白(TTR)基因突变引起的遗传性、致命性疾病。TTR蛋白主要在肝脏中产生，通常是维生素A的载体。TTR基因突变会导致异常淀粉样蛋白积累，并损害身体器官和组织。所以归根到底是一类基因突变导致的临床疾病。帕替西伦以脂质体为载体，内含siRNA靶向突变的TTR基因，消除淀粉样病变蛋白的堆积。
3. mRNA疫苗
3.1 mRNA疫苗的作用机制
RNA疫苗引发适应性免疫反应的关键是树突状细胞成功靶向MHC I类和MHC II类分子并呈递由mRNA编码的表位[7]。
首先将抗原编码序列的DNA质粒线性化，作为模板用于体外转录。体外转录的mRNA包含5‘帽、5′和3′非翻译区（UTR）、开放阅读框（ORF）和poly（A）尾，这些决定了mRNA转移到细胞后的翻译活性和稳定性。①：外源性mRNA的一部分逃脱了普遍存在的核糖核酸酶的降解，并被细胞特异性机制自发地内吞（例如，未成熟树突状细胞中的大胞饮作用），并进入内体途径。②：mRNA进入细胞质的释放机制尚不完全清楚。③：mRNA的翻译利用宿主细胞的蛋白质合成机制。mRNA翻译的限速步骤是真核翻译起始因子4E（eIF4E）与帽结构的结合。④：通过核酸外切酶催化mRNA降解终止翻译。帽状结构被酶DCP1、DCP2和DCPS32水解，然后被5′-3′核糖核酸外酶1（XRN1）消化残留的mRNA。⑤：翻译的蛋白质产物经过翻译后修饰，其性质取决于宿主细胞的特性。翻译后的蛋白质可以在产生它的细胞中发挥作用。⑥：或者，蛋白质产物是分泌的，并可能通过自分泌、旁分泌或内分泌机制发挥作用。⑦：对于mRNA的免疫治疗用途，蛋白质产物需要降解为抗原肽表位。这些肽表位被装载到主要组织相容性复合体（MHC）分子上，这确保了这些抗原向免疫效应细胞的表面呈递。细胞质蛋白被蛋白酶体降解并进入内质网，在那里它们被装载在MHC I类分子上，以呈递给CD8+细胞毒性T淋巴细胞。⑧：在抗原呈递细胞中，为了使T细胞发生更有效持续的免疫反应，蛋白质产物需要进入MHC II类装载区。此外，被树突细胞吸收的外源性抗原也可以通过一种称为交叉引发的机制装载到MHC I类分子上。⑨：蛋白质衍生的表位由MHC I类和MHC II类分子呈现在细胞表面。进而刺激机体产生抗体。
3.2 mRNA疫苗的挑战
mRNA疫苗相比于传统疫苗有一个非常明显的问题——易降解，半衰期短。为了解决这个问题，我们根据mRNA的结构可以进行功能改造，其中就包括了：5‘帽、3‘尾、非翻译区域（UTR）和开放阅读框（ORF）。
5‘帽：mRNA的翻译需要一个功能性的5ʹ帽（m7GpppN）结构。这个结构与真核细胞翻译起始因子4E (EIF4E)的结合对有效翻译至关重要，而与mRNA脱帽酶DCP1、DCP2负责水解这种结构。最近，一种含硫代磷酸的cap类似物被研制出来。这种帽状类似物提供了对DCP2脱帽的抵抗，从而进一步延长了mRNA40的半衰期。在小鼠身上进行的实验表明，含有硫代修饰帽的IVT mRNA对编码的蛋白质诱导了有效的免疫应答，这种应答比对照的mRNA诱导的免疫应答更强[8]。
3‘尾：poly(A)尾巴与5 '帽、内部核糖体进入位点和各种其他决定因素协同调节mRNA的稳定性和翻译效率。IVT mRNA的尾巴要么通过编码模板载体中的poly(A)延伸来转录，要么通过两步反应来延伸IVT mRNA，使用重组poly(A)聚合酶。重组聚(A)聚合酶使修饰的核苷酸结合到聚(A)尾部以抑制聚(A)特异性核酸酶的去腺苷酸化。这种方法已经被用于各种核苷类似物，包括虫草素(3ʹ‑deoxyadenosine)。
非翻译区域（UTR）：优化细胞内IVT mRNA翻译和稳定性的另一个策略是加入5ʹ-和3ʹ-UTRs，它们包含已被鉴定为调节内源性mRNA翻译和稳定性的调控序列元件，例如：防止5‘外切酶活性的元件。
开放阅读框（ORF）：密码子的组合会影响翻译效率。用同义的频繁密码子替换罕见密码子可以提高翻译产量，因为由于核糖体附近的tRNA的氨基酰化作用，重复使用相同的tRNA会加速翻译。密码子的背景(即邻近的核苷酸和密码子)也影响翻译延伸率和翻译效率。类似于基于重组DNA的方法，密码子优化的IVT mrna已成功用于抗病毒感染的疫苗研究和非病毒蛋白的表达。
3.3 Drew Weissman 和Katalin Karikó 的贡献
mRNA疫苗还会存在另一个问题：引起强烈的炎症反应。细菌进入机体后会携带外源DNA，人体细胞上存在这样一种受体，识别外源性的核苷酸进而刺激机体做出应答，即Toll样受体。疫苗里预存的mRNA同样会被识别并引发炎症反应。在Drew Weissman和Katalin Karikó的研究中发现：当HEK293细胞过表达Toll样受体3（TLR3）时，这些炎症细胞因子的分泌显著增加，并且IFN-β分泌的增加通过共表达含有TIR结构域的适配器诱导IFN-β的抑制剂（与IFN调节因子3信号传导相关的TLR3适配器蛋白）而被抑制[9]。
很快，在2005年，两人发表论文指出，重新编排mRNA的一个核苷酸——尿苷——的化学键 ，就能创造出一种名为假尿苷的类似物，掺入修饰的核苷m5C、m6A、m5U、s2U或假尿苷可防止机体将合成mRNA视为敌人[10]。从此以后，mRNA疫苗投入临床使用的步伐大大加快。
4. 结语
Only imagination will limit the use of mRNA
5. 参考文献
1. Li, M., et al.,COVID-19 vaccine development: milestones, lessons and prospects.Signal Transduct Target Ther, 2022.7(1):p. 146.
2. Lamb, Y.N.,BNT162b2 mRNA COVID-19 Vaccine: First Approval.Drugs, 2021.81(4): p.495-501.
3. Efficient in vitro synthesis of biologically active RNA and RNAhybridization probes from plasmids containing a bacteriophage SP6promoter.
4. Functional messenger RNAs are produced by SP6 in vitrotranscription of cloned cDNAs.
5. Characterization of a Messenger RNA Polynucleotide VaccineVector .
6. Dendritic cells pulsed with RNA are potent antigen-presentingcells in vitro and in vivo .
7. Sahin, U., K.Kariko, and O. Tureci,mRNA-based therapeutics--developing a new class of drugs.Nat Rev Drug Discov, 2014.13(10): p. 759-80.
8. Weng, Y., et al.,The challenge and prospect of mRNA therapeutics landscape.Biotechnol Adv, 2020.40: p. 107534.
9. Kariko, K., et al.,Small interfering RNAs mediate sequence-independent gene suppression and induce immune activation by signaling through toll-like receptor 3.J Immunol, 2004.172(11): p. 6545-9.
10. Kariko, K., et al.,Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA.Immunity, 2005.23(2): p.165-75.
