希望可以认识志同道合的学习和研究的小伙伴。有一个最近日更的公众号（疫情期间在家更新很勤，以后开学了大概2-3天更新一篇学习笔记，文献阅读或者其他随笔，分子生物学，病毒学方向）——番茄随笔（二维码在个人主页），欢迎关注，欢迎留言，我们一起讨论问题呀。
一、前言：
分子生物学着重于分子机制的研究，即基因与基因组的结构和功能，生物大分子执行功能的过程。这个领域的发展源于工具和方法的发展，每一场技术革命都让分子生物学焕发新生。
时间久远的书和文献里面的发现，现在大多被当成了技术在应用，每每看到都让我感慨科学的成长和活力；也惭愧自己站在巨人的肩膀上，却只是数着脚下的沙砾，并没能远眺前方。
从第一次猜想DNA结构，到第一个限制性内切酶和质粒的发现，再到新技术用于探测和扩增DNA。我们稳步进入了全基因组时代，甚至后基因组时代，各种组学层出不穷......
二、翻翻分子生物学家的工具箱
1.克隆（clone）：获得目的基因。
2.表达（expression）：表达新性状或者收获目的蛋白。
3.核酸酶（nuclease）：能够将聚核苷酸链的磷酸二酯键切断的酶，称为核酸酶。
（1） 核酸外切酶（exonuclease ）：核酸外切酶是一类从多核苷酸链的末端开始逐个降解核苷酸的酶。比如exoⅠ，exoⅢ，exoⅦ，λexo等。
（2） 核酸内切酶（endonuclease）：可水解分子链内部磷酸二酯键生成寡核苷酸的酶，与核酸外切酶相对应。例如DNaseⅠ，DNaseⅡ，RNase、RNaseT1等。前两个定义抛砖引玉，下面看应用最为广泛的：
（3） 限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）：是可以识别并附着特定的脱氧核苷酸序列，并对每条链中特定部位的两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶，简称限制酶，有三种类型。如Bam H，EcoRⅠ，EcoRⅡ，HindⅡ，HindⅢ，HpaI，HpaⅡ，MboI，MboⅡ等，细菌是其主要来源。酶的识别序列，切割位点以及产生的末端都不同。我觉得它是分子试验中最重要的工具。
（4） 限制性酶切位点分布图（restriction map）：又叫物理图谱（physical map）如果我们有一段已知序列，就可以得知它的限制图，这对于后期的试验，如克隆等极其重要（分布图可以用各种各样的基因编辑软件实现，比如DNAstar（没用过），Geneious（在用）等。我这里再推荐一个简洁的网站，功能很多且看起来灰常顺眼，建议收藏http://www.detaibio.com/sms2/）。
4.载体（vector）：承载装置，功能如其名，承载外源插入序列（insert）到受体细胞的工具，我们常用的载体一般来自于质粒和病毒。按照目的分为克隆载体和表达载体
5.转化/转染/转导（具体定义在本公众号《【现学现卖】基因及基本概念》一文中提到）：将目的DNA或者构建好的载体导入宿主细胞的过程，对于不进行生理转化的大肠杆菌，常用的是CaCl2法和电击法；还有一些载体本身是具有侵染性的病毒，那么通过感染就可将DNA导入寄主；与之类似的是脂质体，它可以与细胞膜融合从而将内含物释放入细胞；不得不提的农杆菌转化法；还有显微注射法和基因枪法。这里的分级和分类又有点混乱了，以后有机会再展开讲。
三、专一化的载体
就像我们的螺丝刀刀头分为一字、十字、方头和六角一样，每一种工具为实现不同实验目的而专一化。
载体类别很多，分类标准也是，按照载体本身性质分为病毒载体和非病毒载体（质粒，粘粒等）等；按照功能分为克隆载体和表达载体；按照受体细胞类型分为原核载体，真核载体以及两者均可的穿梭载体。根据不同的实验目的采用不同的载体，并配套使用不同的克隆技术（TA、directing、gateway等等，我发现实验这部分内容真的是难以置信的多，越写越多。）
1. 质粒载体
首先想介绍的是我最近在用的这款pGEM®-T Easy克隆载体，具体实验操作见Promega官方网站。
（1）载体名字组成：p表示是一种质粒（质粒的命名：以p开始，后面用两个大写字母表示发现这一质粒的研究者或者实验室名称比如pUC质粒，后面的数字是指这一系列质粒的编号），GEM是一个系列载体的名称（应该是对之前存在的载体进行改造后重命名的），T是指载体DNA5’端有游离的T（可用于PCR产物的直接克隆，因为一般PCR产物3’端有A碱基，这样目的基因与载体粘端互补）。
（2）物理图谱：
（3）构建之路：调整质粒结构，提高转化率。通常引入MCS（多克隆位点），或引入具有多种用途的辅助序列。比如加入lacZ’、lacⅠ基因获得蓝白斑筛选能力；加入SP6聚合酶启动子获得体外转录能力；加真核启动子则变成穿梭载体等等。在实验时，如果有需要也可以自己构建载体。
pBR322（双抗筛选）+M13mp（lacZ’乳糖操纵子与蓝白斑筛选就不展开了）→pUC18/19（蓝白筛选）
pUC18/19（蓝白筛选）+SP6和T7启动子（体外转录）+T碱基（增强连接效率）→pGEM®-T Easy（蓝白筛选，体外转录（其产物可制备体外翻译的模板，探针及反义RNA），酶切位点丰富（为回收克隆片段，进行亚克隆等提供便利。））
2. 噬菌体载体
λ噬菌体载体
噬菌体：λ噬菌体是大肠杆菌中的病毒，λ-DNA是丝状双链DNA分子，48.5kb，两端各有一个12个核苷酸的互补单链，是天然的粘末端，称为cos位点。
载体构建：通过对λ-DNA进行长度（48.5kb太大了，切掉了不必要的序列）和酶切识别位点的修饰（酶切位点是否成对出现决定了载体是插入型还是替换型），仅保留cos位点，左臂的头尾基因，右臂的裂解基因和需要的酶切位点，构建出了λ噬菌体载体。外源DNA与改造后的λ-DNA重组后，与噬菌体蛋白进行体外包装，可以形成感染力极强的载体，侵染宿主。
优势：与质粒的相比，λ噬菌体载体装载外源DNA量大，可以连接25kb的DNA，且侵染力强，即转导效率高。
M13噬菌体载体
噬菌体：M13噬菌体也是大肠杆菌的病毒，其遗传物质是闭环正链ssDNA，6.4kb。
载体构建：插入标记基因lacZ’，多克隆位点，消除多余的酶切位点。如M13mp18载体的构建。
用途：制备单链DNA，测序，定向克隆。
