01一、文章信息
发表杂志名称：Nature
中文标题：癌症诱导的神经损伤促进抗 PD-1 治疗耐药性
英文标题：Cancer-induced nerve injury promotes resistance to anti-PD-1 therapy
影响因子：48.5
发表日期： 2025 年 8月 10 日
01二、研究概述
神经周浸润（PNI）是多种癌症不良预后的公认因素，但机制尚不明确。本研究揭示了 PNI 和癌症诱导的神经损伤（CINI）在抗 PD-1 治疗耐药中的作用及机制。临床研究发现，在皮肤鳞状细胞癌、黑色素瘤和胃癌患者中，PNI 和肿瘤相关神经（TANs）的 CINI 与抗 PD-1 治疗响应不佳相关。电镜和电传导分析显示癌细胞会降解神经纤维髓鞘，受损神经元通过自主启动 IL-6 和 I 型干扰素介导的炎症来促进神经修复和再生。随着肿瘤进展，CINI 负荷增加，相关炎症转为慢性，使肿瘤微环境（TME）免疫状态偏向抑制和耗竭。通过多种方式靶向 CINI 信号通路，如肿瘤去神经、神经元内介导损伤信号的转录因子 Atf3 条件性敲除、敲除干扰素 -α 受体信号（Ifnar1−/−）或联合抗 PD-1 与抗 IL-6 受体阻断，可逆转 CINI 驱动的抗 PD-1 耐药，证实了 CINI 的免疫调节作用及其治疗潜力。
01三、研究结果
（一）神经损伤与抗 PD-1 治疗耐药相关
作者首先开展临床研究，收集 56 例局部晚期皮肤鳞状细胞癌（cSCC）患者（参与两项抗 PD-1 临床试验）的肿瘤样本，患者先接受 2-4 周期新辅助抗 PD-1 治疗（cemiplimab）再手术（图 1A）。根据手术标本中存活肿瘤细胞比例，将患者分为应答者（<10%，n=33）、无应答者（>50%，n=14），排除 10%-50% 的患者（n=9）（图 1B）。基线时，无应答者的 PNI 发生率显著高于应答者（50% vs 15%，P=0.012）（图 1C）。为验证癌细胞是否损伤浸润神经元，作者用多重免疫荧光（mIF）检测神经元损伤标志物 ATF3 和 JUN，发现无应答者神经元（B3T+GFAP−）中 ATF3 表达高于应答者（P=0.005），而 JUN 表达差异无统计学意义（P=0.55）（图 1D、E）。接着，作者利用已建立的 PNI 基因签名，发现其在 cSCC 临床试验无应答者预处理样本中富集（FDR<0.01）（图 1F），且在黑色素瘤和胃癌的三个公开 RNA 测序队列中，该签名也在抗 PD-1 无应答者预处理样本中富集（FDR<0.01）（图 1G）。在 B16F10-OVA 黑色素瘤肺转移小鼠模型中，荷瘤小鼠颈静脉结状神经节中肺支配伤害性感觉神经元的 Atf3 和 Jun 表达显著上调（FDR 校正 P<0.001）。为验证 CINI 与抗 PD-1 耐药的功能关联，作者进行体内实验：对免疫功能正常的 SKH1-Elite 小鼠进行肿瘤去神经处理（保留皮肤血管），对照组行假手术，随后注射 cSCC 细胞（B610K）并给予抗 PD-1 或 IgG，结果去神经小鼠抗 PD-1 疗效增强（P=0.0027）（图 1H、I）；通过手术轴突切断术诱导神经损伤（图 1J），在 C57BL/6 小鼠中注射 UVcSCC-M4 细胞并给予抗 PD-1，发现轴突切断术小鼠抗 PD-1 治疗的肿瘤控制效果更差（P<0.001）（图 1K）；在人源化 CD34+ NOD scid gamma 小鼠中，轴突切断术且接受抗 PD-1 治疗的小鼠疗效也较差（P<0.01）。本部分结果表明神经损伤与抗 PD-1 治疗耐药相关。
（二）CINI 由髓鞘降解驱动并引发神经元炎症反应
为探究 CINI 机制，作者将背根神经节（DRG）神经元与小鼠 SCC 细胞（Moc1 和 B6）共培养，72 小时内 SCC 细胞表现出向神经性并与轴突直接接触（补充视频 1）。扫描电镜（SEM）显示共培养 5 天癌细胞附着并侵袭神经外膜（图 2A），与正常神经元相比，癌细胞暴露的神经元髓鞘破裂，髓鞘碎片呈圆形聚集（图 2A、B）；透射电镜（TEM）显示神经内膜和轴突水平髓鞘降解，紧密髓鞘板层解开，7 天后接触癌细胞处髓鞘完全丢失，轴突线粒体异常（图 2B、C）。在人口腔 SCC 细胞（HSC-3）显微注射到小鼠右侧坐骨神经的模型中，电镜显示类似髓鞘降解（扩展数据图 4），且未发现癌细胞与神经元间形成突触间隙（图 2C、D）。作者通过多电极阵列（MEA）检测小鼠 cSCC 模型的电传导，发现荷瘤皮肤传导显著低于正常皮肤（41.8μV vs 60.2μV，P<0.0001），且荷瘤皮肤出现复合电位，提示髓鞘降解（图 2E、F）。体外神经元活力实验表明，癌细胞与神经元直接接触导致 48 小时后自发和诱发电活动完全丧失，而条件培养基或外源性应激无此效应。在独立的未治疗 cSCC 患者队列（n=32，n=86 个感兴趣区域）中，mIF 检测显示受损神经（B3T+ATF3+JUN+）密度与降解髓鞘（dMBP+）密度相关（Pearson 相关系数 r=0.79，P<0.0001）（图 2G、H）。作者将人诱导多能干细胞（iPS）来源的 DRG 神经元分别单独培养、与正常角质形成细胞（HEK）或人 cSCC 细胞（IC8）共培养 48 小时，发现与癌细胞共培养的神经元 ATF3 表达最高（P<0.001）（图 2I）。基因集分析显示，与单独培养的神经元相比，与癌细胞共培养的神经元中 12 个显著上调的 Hallmark 基因集中有 6 个与免疫相关（FDR<0.01）（图 2J），而神经元与正常角质形成细胞共培养或神经元暴露于抗 PD-1 时，未检测到神经损伤或免疫相关转录变化。用 Luminex 免疫测定法检测小鼠三叉神经节（TG）神经元与 MOC1 SCC 细胞共培养上清液，发现 IL-6 在神经元暴露于癌细胞后分泌增加最显著，且癌细胞不分泌 IL-6（图 2K）。本部分结果阐明 CINI 由髓鞘降解驱动，进而引发神经元炎症反应。
（三）CINI 抑制抗肿瘤免疫活性并影响肿瘤微环境
作者将 MOC2 SCC 细胞注射到小鼠 whisker pad（高度神经支配区域），在不同时间点（7、9、11、13 天）提取肿瘤，发现受侵袭神经数量在 11 天达到饱和（图 3A）。mIF 染色显示，NFH+ATF3 + 受损神经数量增加时，整个 TME 中免疫抑制性巨噬细胞（CD68+CD163+PD-L1+）和耗竭 CD8+ T 细胞（CD8+TIM3+）浸润也增加（图 3B）。在未治疗 cSCC 患者肿瘤中，mIF 显示 CINI 神经（NFH+ATF3+）的神经周微环境中免疫抑制性巨噬细胞（CD163+PD-L1+）和中性粒细胞胞外陷阱（MPO+C3H+）浸润增加（图 3C 上），在胰腺癌（PDAC）患者中也观察到类似模式（图 3C 下）。对 7 例未治疗 PDAC 患者肿瘤进行 CosMx 空间转录组分析，将 TANs 分为受损（ATF3 和 JUN 均表达）、中间（仅一种表达）和未受损（均不表达）三类，发现受损神经的神经周微环境中 CD163 + 巨噬细胞和 LAG3+CD8+ T 细胞浸润更高（P=0.018 和 P=0.048）（图 3D）。作者用 GeoMx 数字空间分析（DSP）评估 cSCC 新辅助临床试验样本的神经微环境，发现无应答者（n=109 个 ROI）肿瘤中神经退行性蛋白标志物（如 PARK7、PINK1）表达增加（FDR<0.01）（图 3E），应答者预处理样本神经周微环境中神经保护蛋白 APOA-I 过表达（FDR<0.01）（扩展数据图 7E），且 CD31 表达在应答者和无应答者间无差异（FDR=0.76）（扩展数据图 7F）。DSP 蛋白表达数据分析显示，新辅助治疗后无应答者神经周微环境中神经元损伤标志物与免疫激活和抑制标志物均呈正相关，而应答者多呈负相关（图 3F）。mIF 验证显示，新辅助治疗后无应答者神经周微环境中 CD68+CD163+、CD8+PD-1 + 和 CD8+LAG3 + 细胞数量高于应答者（P=0.055、P=0.078、P=0.095）（图 3G）。对 11 例未治疗 cSCC 患者新鲜肿瘤样本进行空间转录组分析，发现 CINI 表型与免疫抑制炎症表型相关（r=0.44），与抗肿瘤免疫表型无相关（r=0.13），61.1% 的显著 CINI 区域（倍数变化> 2，FDR<0.01）与免疫抑制表型共定位（P<0.001）（图 3H）。mIF 检测显示，在有 PNI 的神经周微环境中 CD8+LAG3 + 和 CD163+PD-L1 + 免疫抑制细胞的存在，与神经远端区域的浸润模式相关（r=0.5，P=0.011；r=0.67，P<0.001），而无侵袭神经无此空间一致性（图 3I）。本部分结果表明 CINI 可抑制抗肿瘤免疫活性，并将肿瘤微环境免疫状态转向抑制状态。
（四）减轻外周感觉神经元损伤信号可改善肿瘤内免疫抑制
作者将 B16F10-OVA 黑色素瘤细胞或非致瘤性角质形成细胞注射到小鼠后爪，14 天后收集支配该爪的 L3-L5 DRG 神经元进行单细胞 RNA 测序（scRNA-seq），发现黑色素瘤支配的神经元中富集一种名为 “癌症损伤神经元（CIN）” 的独特亚群，占黑色素瘤组的 4.5%（710 个神经元），而角质形成细胞组不足 0.1%（12 个神经元）（图 4A）。CIN 的特征是神经损伤相关基因富集，其中 Atf3 表达显著（图 4B），且多个免疫相关通路上调（FDR<0.001）（扩展数据图 9C、D）。为检测阻断 CINI 信号对肿瘤生长和肿瘤内免疫活性的影响，作者使用伤害性感觉神经元中 Atf3 条件性敲除（Atf3-cKO）小鼠（Nav1.8Cre::Atf3fl/fl）及其同窝对照小鼠（Nav1.8WT::Atf3fl/fl），注射 B16F10-OVA 黑色素瘤细胞，发现 Atf3-cKO 小鼠黑色素瘤体积小于对照小鼠（P<0.01）（图 4C、扩展数据图 9H），且肿瘤中 IFNγ+CD8+ T 细胞浸润增加（P=0.04）（图 4D、扩展数据图 10A）。对肿瘤内免疫细胞（CD45+）进行 scRNA-seq，发现两组免疫细胞（巨噬细胞、B 细胞、中性粒细胞、T 细胞）比例无差异（图 4E），但 Atf3-cKO 小鼠肿瘤中 CD8+ T 细胞的耗竭标志物（如 Lag3，P=0.05）表达降低（图 4F），巨噬细胞表现出 M1 样表型（Il1b+Cd86+Cd80+），相关标志物表达升高（Il1b，P=0.006；Cd86，P=0.022；Cd80，P=0.0003）（图 4G），而对照小鼠巨噬细胞中 IL-6 信号等炎症通路富集（图 4H）。本部分结果表明减轻外周感觉神经元内的损伤信号可改善肿瘤内免疫抑制状态。
（五）阻断 CINI 的有害炎症信号可增强抗 PD-1 疗效
作者对 cSCC 新辅助抗 PD-1 临床试验样本进行免疫组化染色，发现应答者和无应答者在治疗前后 CD8+ T 细胞数量无差异（图 5A），但无应答者新辅助治疗后肿瘤中 PD-1 总体表达显著更高（P=0.03）（图 5B）。基因本体（GO）通路分析显示，应答者新辅助治疗后肿瘤中抗肿瘤免疫相关通路（如 T 细胞活化，GO:0042110，FDR=0.001；IL-6 产生负调控，GO:0032729，FDR=0.03）上调，而无应答者中免疫抑制通路（如 IL-10 产生，GO:0032733，FDR=0.03；伤口愈合，GO:0042060，FDR<0.01）上调（图 5C）。NanoString nCounter PanCancer 免疫分析显示，无应答者新辅助治疗后肿瘤中 I 型干扰素（IFN-I）信号上调（图 5D-F）。为验证阻断 IFN-I 或 IL-6 信号能否增强抗 PD-1 疗效，作者首先使用 IFNα 受体亚基 1 敲除（Ifnar1-KO）小鼠模型，在小鼠脚垫接种 UVSCC-M4 细胞，17 天后在肿瘤 - 正常皮肤界面注射脱髓鞘剂（溴化乙锭，EtBr）或 PBS，2 天后给予抗 PD-1 或对照抗体，部分组联合 STING 激动剂。结果显示，在脱髓鞘和抗 PD-1 治疗情况下，野生型（WT）EtBr 小鼠肿瘤控制最差，肿瘤显著大于 WT 假手术和 Ifnar1-KO EtBr 组（P<0.01），而 Ifnar1-KO 小鼠不受脱髓鞘影响，且添加 STING 激动剂未改善抗 PD-1 疗效（图 5G-I）；基于肿瘤活力，脱髓鞘对 WT 小鼠抗 PD-1 疗效有不利影响（P<0.01）（图 5J）。接着，作者测试 IL-6 信号阻断的影响，在 C57BL 小鼠中接种 UV 诱导的 cSCC M4 细胞，1 周后在肿瘤周围注射 EtBr 或 PBS，2 天后开始抗 PD-1 治疗，前两次单独使用抗 PD-1，后续联合抗 IL-6 受体抗体。结果显示，联合抗 IL-6R 未显著降低肿瘤大小（图 5L），但显著降低脱髓鞘小鼠的肿瘤活力（P<0.001），而无脱髓鞘小鼠中无此效果（图 5M）。本部分结果表明阻断 CINI 相关的有害炎症信号（如 IFN-I 或 IL-6 信号）可增强抗 PD-1 治疗的疗效。
本研究深入探究了癌症诱导的神经损伤（CINI）在抗 PD-1 治疗耐药中的作用及机制。首先通过临床样本分析，发现神经周浸润（PNI）和 CINI 与皮肤鳞状细胞癌、黑色素瘤、胃癌患者抗 PD-1 治疗响应不佳相关，且 PNI 基因签名在无应答者样本中富集。接着从机制上证实，癌细胞通过直接接触降解神经纤维髓鞘引发 CINI，受损神经元自主启动 IL-6 和 I 型干扰素介导的炎症以促进神经修复，但随着肿瘤进展，炎症转为慢性，使肿瘤微环境免疫状态偏向抑制和耗竭，进而导致抗 PD-1 治疗耐药。体内外实验进一步验证了 CINI 与抗 PD-1 耐药的关联，且通过肿瘤去神经、敲除神经元中 Atf3 基因、阻断 IFN-α 受体信号或联合抗 PD-1 与抗 IL-6 受体阻断等方式，可逆转 CINI 驱动的抗 PD-1 耐药，增强治疗疗效。该研究揭示了 CINI 介导抗 PD-1 治疗耐药的新机制，为开发克服免疫治疗耐药的策略提供了重要依据，有望为癌症患者的临床治疗带来新方向。
