在主流分子生物学与细胞机制研究实验中，绝大多数核心技术的实验结论，最终都需要依托WB实验完成蛋白层面的验证与佐证。如Co-IP、Pull-down、IP-MS、CETSA、检测细胞凋亡、通路活化、基因过表达与敲低的功能实验等，最终均需依靠WB实验进行结果展示。所以，WB实验广泛应用于蛋白互作、药物药效验证、疾病标志物筛选等各类科研场景。
本文针对WB实验各步骤展开了详细解读，包含实验流程、具体操作注意事项、常见条带问题与解决方案等，老师可根据需求滑动至相应小标题处阅读。
一、WB实验标准流程
二、WB实验前准备阶段
实验前期的调研与准备工作至关重要，也是规避条带异常、结果假阳性、数据无法解释等问题的核心前提。
1、目的蛋白的基础信息
明确蛋白分子量、组织表达特异性、可变剪切形式及翻译后修饰特征，同时规范规划上样顺序、严格设置各类实验对照，为后续实验开展与结果分析筑牢基础，也能在结果出现偏差时快速定位问题、高效排查溯源。
在蛋白背景调研中，可依托权威数据库与相关文献，精准掌握蛋白核心信息，适配不同研究需求：
1、目的蛋白的组织、细胞表达分布与基础表达丰度：
BioGPS：参考不同种属样本的mRNA表达水平，预判样本适配性
HPA数据库：查阅人类蛋白的组织与细胞定位特征，匹配实验样本选择
2、蛋白详细属性、亚型及修饰信息
UiProt：查询蛋白官方名称、功能定位、可变剪切体、基础理化性质
PhosphoSitePlus：明确蛋白修饰位点、激活条件、表达丰度及诱导刺激方式，有效避免因不了解蛋白修饰特性导致的条带缺失、杂带干扰等问题。
2、标准化的实验前置设计
①实验前需提前根据蛋白分子量确定胶浓度、电泳及转膜参数；
②合理规划样本点样顺序，保证组别排布规整、操作规范，规避上样误差；
③必须设置完善的实验对照：阳性对照选用明确高表达目的蛋白的样本，验证抗体有效性与实验体系可行性；阴性对照选取无目的蛋白表达的样本，排除抗体非特异性结合、试剂污染等干扰；搭配内参对照校正上样误差。
三、WB实验流程注意事项
1、蛋白样品制备
蛋白样品制备是WB实验的第一步，也是决定条带清晰、无降解、无杂带的关键步骤。不同来源的实验样本，蛋白提取方式存在明显差异，需根据样本类型选择适配的提取方案，同时严格遵循低温、防降解的核心原则，最大程度保留蛋白完整性与活性。
1）不同样本类型提取方案
① 细菌样本：收集菌液后离心去除上清，采用等渗中性溶液反复洗涤菌体，去除残留培养基杂质，后续配合专用细菌蛋白抽提试剂盒进行蛋白提取，保障细菌蛋白的完整析出。
② 细胞样本：优先选择培养皿原位裂解或细胞刮收集细胞后裂解，不建议使用胰酶消化，避免胰酶作用破坏蛋白结构、导致蛋白降解或表达异常，影响实验结果准确性。
③ 植物组织样本：使用蛋白质提取液或专用植物蛋白抽提试剂盒，有效去除杂质干扰，高效提取高质量总蛋白。
④ 动物组织样本：可选用标准RIPA裂解液或适配的组织裂解液进行裂解，配合低温研磨、超声破碎处理，充分破碎组织细胞，释放完整蛋白，适配常规动物组织蛋白检测实验。
2）样品制备核心注意事项
无论何种样本类型，蛋白提取全程需严格把控防降解、防失活关键细节。
②若实验需检测磷酸化蛋白、乙酰化蛋白等修饰型蛋白，需额外添加磷酸酶抑制剂，杜绝修饰位点丢失，保障蛋白修饰状态真实可测。
③所有裂解、静置、离心操作全程冰上进行，低温环境可最大程度抑制酶活性、延缓蛋白降解。
2、凝胶电泳
1）选择合适的蛋白Marker
蛋白 Marker 是一组已知分子量的混合蛋白，在实验中充当分子量参照标准，主要作用：
①判定目标蛋白的分子量；
②观察电泳分离效果，把控实验进程；
③检验蛋白转膜是否充分、完整。
2）选择合适的凝胶浓度
根据蛋白分子量的大小，选择合适浓度的分离胶，可参考凝胶配置试剂盒中的说明书，或者参考文献。配胶的APS需要在4℃的冰箱中保存。注意，配胶的时候，胶需要充分混匀。配胶的试剂中，APS与TEMED是促凝剂，所以在加促凝剂之前，需先把其他组分混匀。
3）电泳电压、电流设置 & 跑胶时间
WB 电泳分浓缩胶和分离胶两个阶段，主流采用恒压模式，先用80 V恒压电泳至溴酚蓝指示剂到浓缩胶与分离胶交界处，成线状，改为恒压120 V直至溴酚蓝电泳到凝胶底部，此过程约用时1.5 h；也可使用恒流模式。
根据实验要求可以进行适当调整，蛋白条带较大时，可延长电泳时间；条带较小时，参照预染Marker条带决定电泳时间。小分子蛋白极易随溴酚蓝跑出凝胶，临近终点时多观察，切勿过度跑胶。
3、转膜
转膜是WB实验中决定条带完整度、均匀度的关键步骤，转膜条件不当极易造成条带空白、缺失、深浅不均、转膜不全或过度转膜等问题。为保证蛋白能够完整、均匀地从凝胶转移至膜上，实验过程中需严格遵循以下操作要点。
1）实验前需提前配制转膜缓冲液并放置4℃预冷备用，保证全程低温转膜环境，可最大程度维持转膜体系稳定。
2）组装“滤纸-胶-膜”三明治结构时，需逐层仔细检查并赶除气泡，胶与膜之间绝对不能残留气泡，否则会阻断蛋白转移，造成条带白斑、缺块、转膜不均等现象。组装时严格遵守黑胶白膜原则，转膜夹黑色面贴近凝胶、白色面贴近膜，保证电极方向正确，避免出现反向转膜、完全无条带等问题。
3）转膜过程中可通过观察转膜槽内是否持续产生细小气泡，直观判断转膜是否正常进行。
4）根据目标蛋白分子量选择适配孔径膜材：小分子蛋白优先选用0.22 μm PVDF膜，避免蛋白穿膜丢失；大分子蛋白选用0.45 μm PVDF膜，保证转膜效率。
4、封闭
封闭的目的，就是用一种惰性的、非靶标的蛋白质或分子去“填满”这些空位，把非特异性结合位点“堵住”，让后续加入的一抗、二抗只能特异性结合到目标蛋白上，从而获得清晰、干净、特异的条带信号。
1、不同封闭试剂的选择
脱脂奶粉：非磷酸化蛋白检测、非生物素系统检测（如HRP或AP直接标记二抗）
牛血清白蛋白 (BSA)：万能首选，尤其推荐用于：磷酸化蛋白检测、使用生物素-亲和素系统的检测、需要高稳定性和可重复性的实验、PVDF膜。
2、封闭时间
常规范围： 室温 (RT) 摇床封闭 1小时 。对于背景特别高或膜结合能力强的样品，可延长至 1.5-2小时。
低温过夜： 4°C 过夜封闭
5、抗体孵育
抗体孵育是核心检测步骤，其原理基于抗原-抗体特异性结合的免疫学反应，通过一级抗体（一抗）和二级抗体（二抗）的级联放大效应，实现对目标蛋白的高灵敏度检测。
通常根据抗体说明书按比例进行现配现用，避免反复冻融；孵育温度一般为室温或4°C，后者适用于低丰度靶标以提升信噪比；摇床温和震荡确保均匀接触；一抗孵育时间通常为常温1–2小时或4°C过夜，二抗则多为室温1小时；每次孵育后需用TBST充分洗涤3–5次，每次5分钟，以减少非特异性结合。
6、显影分析
通常采用化学发光法进行显影，注意试剂需要按比例现配现用。
