文献题目：A Novel CsYABBY3-CsAS1 Feedback Loop Coordinates Trichome Differentiation and Cannabinoid Biosynthesis inCannabis sativaL.
发表期刊：Advanced Science
影响因子：14.1
发表时间：2026年3月11日
物种：大麻
发表单位：中国中医科学院
蓝景科信提供：DAP-seq技术服务
主要研究结果
大麻（Cannabis sativa L.）产生的大麻二酚（CBD）等萜酚类次生代谢产物（大麻素）具有重要的药用价值。腺毛（Glandular trichome）作为大麻生物合成和储存大麻素的微工厂，尽管已知其发育往往伴随着特异性代谢物的产生，但协调这两个过程的分子开关和调控网络在此前仍不十分明确。
研究团队利用多品种大麻以及多组织部位转录组，筛选并鉴定出大麻腺毛特异性高表达的FIL/YAB3家族转录因子CsYABBY3。功能验证表明，该因子不仅能促进腺毛的分化，还能显著提升CBD和CBG等主要大麻素的积累。研究通过DAP-seq全基因组结合位点分析，共鉴定出3154个CsYABBY3结合峰，其中约12.4%位于基因转录起始位点上游2kb的启动子区域，并鉴定到显著富集的核心结合基序TAATTAA。GO与KEGG富集显示，这些靶基因显著富集于萜类骨架合成、单萜生物合成及脂肪酸代谢通路。酵母单杂交与双荧光素酶实验进一步证实，CsYABBY3能够直接结合大麻素合成关键基因CsPT4和CsCBDAS的启动子，并激活二者的转录，进而正向调控大麻素生物合成。此外，研究还发现R2R3-MYB转录因子CsAS1同样可独立正向调控大麻素合成通路。通过ITC、LCI、Co‑IP及Y2H等多项互作实验证实，CsYABBY3与CsAS1存在直接物理相互作用，二者形成转录复合体，协同增强下游大麻素合成基因的表达。
本研究揭示了一条新型正反馈转录调控回路，实现了腺毛的分化与特异性代谢物合成的精准偶联，不仅深化了对大麻素生物合成的分子调控理论，也为大麻品种的定向改良与大麻素高效代谢工程提供了关键科学依据。
图1.大麻中CsYABBY3的鉴定与表达模式。（A）扫描电镜观察大麻不同组织表面的各类腺毛（GT）形态。（B）扫描电镜观察大麻叶片、苞片与糖叶的毛状体特征。（C）基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI MSI）显示大麻叶片、苞片和糖叶中主要大麻素的相对分布。（D）CsYABBYs蛋白与其他植物同源蛋白的系统发育树。（E）DiKu大麻品种中，大麻素合成通路相关酶、CsYABBYs（蓝色）与大麻素（绿色）的表达热图。（F）qPCR检测CsYABBY3在不同叶片组织中的表达水平。（G）CsYABBY3在营养叶片切片中的RNA原位杂交结果。
图2.CsYABBY3对大麻中大麻素含量及CBDA合成基因表达的调控。（A、B）CsYABBY3瞬时过表达大麻叶片（A）与CsYABBY3稳定过表达毛状根（B）中的总CBD和总CBG含量。（C、D）CsYABBY3瞬时过表达大麻叶片（C）与CsYABBY3稳定过表达毛状根（D）中CBDA合成基因的qRT-PCR分析。（E、F）病毒诱导基因沉默（VIGS）（E）与RNA干扰（RNAi）（F）介导的CsYABBY3沉默株系中的总CBD和总CBG含量。（G、H）VIGS（G）与RNAi（H）介导的CsYABBY3沉默株系中CBDA合成基因的qRT-PCR分析。
图3.CsYABBY3直接激活CsPT4与CsCBDAS的表达。（A）酵母单杂交（Y1H）实验显示CsYABBY3结合CsPT4启动子（CsPT4pro）。（B）MST分析CsYABBY3与Cy5标记的CsPT4启动子、CsCBDAS启动子（CsCBDASpro）的相互作用。（C）在本氏烟叶片中进行的双荧光素酶（Dual-LUC）实验，证明CsYABBY3对CsPT4启动子与CsCBDAS启动子具有转录激活作用。（D、E）通过酵母单杂交检测CsPT4启动子截短片段（P1-P3）与CsCBDAS启动子截短片段（P1-P3）与CsYABBY3的结合情况。（F）双荧光素酶实验表明，CsYABBY3在本氏烟叶片中可激活CsPT4-P1启动子、CsPT4-P2启动子与CsCBDAS-P1启动子。（G）DNA亲和纯化测序（DAP-seq）两个生物学重复中鉴定到的共有结合峰（3154个）。（H）CsYABBY3结合位点在基因组上相对于基因功能元件的分布。（I）3154个DAP-seq峰附近基因的KEGG注释，重点富集萜类骨架合成与单萜合成通路。（J）从CsYABBY3的DAP-seq峰中鉴定出的得分最高的DNA基序，及其在CsPT4启动子与CsCBDAS启动子上的定位。（K）酵母单杂交与MST实验中使用的野生型（WT）与突变型探针。（l）酵母单杂交验证CsYABBY3结合CsPT4启动子的核心基序。（M）MST验证CsPT4启动子与CsYABBY3的相互作用。
图4. CsYABBY3与CsAS1的互作机制。（A、B）酵母双杂交（Y2H）实验（A）和荧光素酶互补成像（LCI）实验（B）证明CsYABBY3与CsAS1存在蛋白相互作用。（C）免疫共沉淀（Co-IP）实验验证CsYABBY3与CsAS1的互作。（D）CsYABBY3与CsAS1互作的ITC分析。（E）CsYABBY3与CsAS1的蛋白结构预测与分子对接结果。（F）CsYABBY3-CsAS1互作界面示意图，标注8个关键互作位点（#1–#8）。（G）评估CsAS1与CsYABBY3互作的MST实验。（H）酵母双杂交实验验证CsYABBY3突变体#1–#8与CsAS1的互作情况。
图5.CsAS1是CBDA生物合成的正向调控因子。（A）CsAS1稳定过表达毛状根中总CBD与总CBG含量（左图），以及CsPT4和CsCBDAS的表达水平（右图）。（B）病毒诱导基因沉默（VIGS）介导的CsAS1沉默株系中总CBD与总CBG含量（左图），以及CsPT4和CsCBDAS的表达水平（右图）。（C）酵母单杂交（Y1H）实验显示CsAS1可结合CsPT4启动子（CsPT4pro）。（D）MST分析CsAS1与Cy5标记的CsPT4启动子、CsCBDAS启动子（CsCBDASpro）的相互作用。（E）双荧光素酶（Dual-LUC）实验证明CsAS1在本氏烟叶片中可激活CsPT4启动子与CsCBDAS启动子。（F）通过JASPAR数据库预测的CsAS1在CsPT4启动子与CsCBDAS启动子上的潜在结合位点。（G、H）酵母单杂交实验显示CsAS1可结合CsPT4-P1启动子、CsPT4-P2启动子（G），以及CsCBDAS-P1启动子、CsCBDAS-P3启动子（H）。（I、J）双荧光素酶实验证明CsAS1在本氏烟叶片中可激活CsPT4-P1启动子、CsPT4-P2启动子（I），以及CsCBDAS-P1启动子、CsCBDAS-P3启动子（J）。
图6.CsYABBY3与CsAS1相互激活并形成正反馈调控环路。（A）酵母单杂交（Y1H）实验显示CsYABBY3结合CsAS1启动子（CsAS1pro）。（B）MST分析Cy5标记的CsAS1启动子（靶标）与CsYABBY3蛋白（配体）之间的相互作用。（C）双荧光素酶（Dual-LUC）实验证明CsYABBY3在本氏烟叶片中激活CsAS1启动子。（D）qRT-PCR分析CsAS1在CsYABBY3过表达株系与VIGS介导的CsYABBY3沉默株系中的表达水平。（E）酵母单杂交实验显示CsAS1结合CsYABBY3启动子（CsYABBY3pro）。（F）MST分析Cy5标记的CsYABBY3启动子（靶标）与CsAS1蛋白（配体）之间的相互作用。（G）双荧光素酶实验证明CsAS1在本氏烟叶片中激活CsYABBY3启动子。（H）qRT-PCR分析CsYABBY3在CsAS1过表达株系与CsAS1沉默株系中的表达水平。
图7.CsAS1与CsYABBY3互作激活CsPT4启动子和CsCBDAS启动子的转录水平。（A）双荧光素酶实验显示，CsYABBY3与CsAS1共表达可激活全长CsPT4启动子和CsCBDAS启动子。（B–D）瞬时表达实验表明，CsYABBY3-CsAS1模块在本氏烟叶片中可激活CsPT4-P1启动子（B）、CsPT4-P2启动子（C）和CsCBDAS-P1启动子（D）。（E、F）MST实验检测Cy5标记的CsPT4启动子（E）和CsCBDAS启动子（F）与CsYABBY3/突变体-CsAS1复合物的结合能力。（G）CsYABBY3突变体#7与CsAS1瞬时共表达会抑制CsPT4启动子和CsCBDAS启动子的活性。
图8.YABBY-AS1结构界面的进化保守性及大麻素生物合成调控模型。（A）不同植物类群中YABBY基因家族的最大似然系统发育树，突出显示了大麻（C. sativa）CsYABBY1 和CsYABBY3的进化位置（红色圆点标注）。（B）CsYABBY3-CsAS1互作界面第7号活性位点的结构模拟，展示了涉及M199的预测氢键（键长2.8Å）。（C）CsYABBY3与同源蛋白的序列比对。（D）酵母双杂交（Y2H）实验验证YABBY-AS1蛋白互作在核心真双子叶植物（大豆、拟南芥、番茄）中的功能保守性。（E）大麻中CsYABBY3-CsAS1调控模块的作用模型。
