Transient hepatic reconstitution of trophic factors enhances aged immunity (part 2)

Part2: Reconstituting immune cues in the liver:

Para1:
鉴于老年个体胸腺功能退化，直接递送mRNA难以有效表达蛋白。相比之下，老年肝脏蛋白质合成能力依然强大，且血流丰富、与全身免疫系统联系紧密，能高效调控循环T细胞。因此，本研究采取了一种替代策略：将随年龄在胸腺中缺失的关键免疫信号（如Notch、FLT3L与IL-7），通过mRNA递送方式“移植”至肝脏，实现其功能的异位重建。

Tip：本研究选择使用mRNA递送而非重组蛋白，原因在于重组细胞因子在体内清除迅速，需要频繁高剂量给药，易导致显著毒副作用。相比之下，mRNA的蛋白表壳更可控，同时不良反应较弱。

选择SM-102脂质纳米颗粒，递送包含靶基因的mRNA至肝细胞(下文简称DFI)，Luc与GFP mRNA作为对照。(Fig. 1e)。实验证实，经转染的原代肝细胞可在表面高表达DLL1，并分泌高水平的IL-7与FLT3-L (Extended Data Fig. 4a–c)。经静脉全身性注射LNP后，其翻译活性主要集中于肝脏 (Fig. 1f and Extended Data Fig. 4d,e)。（所以，选择肝脏作为mRNA翻译的场所一是考虑到胸腺衰退，二是也只能在肝中高效合成）。

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• Fig1e: 使用SM-102脂质纳米颗粒包封mRNA复合物（Dll1、Flt3l及Il7，下文简称“DFI”）。
• Fig1f: DFI处理后6小时的RIBOmap代表图像显示，肝脏中存在大量核糖体结合的转录本。（注：RIBOmap通过原位检测与核糖体结合的mRNA，反映该mRNA在组织中的活跃翻译情况，图中亮度越高代表翻译活性越强。）
• Fig1g:对Fig1f定量的结果，Luc为对照组
• Extended Fig4 A：荧光染色验证原代肝细胞表达DLL因子，表示转染有效（注：DLL是跨膜蛋白）
• Extended Fig4 B：ELISA法检测胞外IL-7和FLT3-L的浓度，表示转染有效（注：这两种是分泌型蛋白）
• Extended Fig4 C：不同剂量DFI mRNA-LNP注射后，小鼠血清中FLT3L与IL-7的蛋白水平（梯度检测最佳注射量）
• Extended Fig4 D：DFI注射6小时后，RIBOmap检测肝脏和脾脏的翻译情况
• Extended Fig4 E：表达三种DFI mRNA的肝细胞Veen图，即有22.8%的细胞可同时翻译这三种蛋白

Para2:
接下来本研究检测了mRNA在体内的代谢情况：Fig. 1h证实DLL1可持续约48小时在肝细胞表面表达；与直接注射FLT3-L蛋白相比，注射FLT3-L mRNA的峰值浓度更高，二者在血液中停留的时间相近 (Fig. 1i)；直接注射重组IL-7蛋白后，血清浓度急剧升高，而注射IL-7 mRNA的峰值要低很多，但维持时间更久 (Fig. 1j)。

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• Fig1h: 使用5 µg DFI处理后DLL1蛋白免疫荧光染色，结果显示肝脏整体及肝细胞表面在48h内持续表达
• Fig1i：注射10 µg重组FLT3-L或5 µg DFI后，ELISA检测血清及肝脏中FLT3-L水平
• Fig1j: 注射10 µg重组IL-7或5 µg DFI后，ELISA检测血清及肝脏中IL-7水平

Para3:
尽管这三种因子在体内的作用时间较长，因此该项目考虑到这么长时间的作用，是否会引发不良反应？接下来，本研究发现，老年小鼠在接受为期四周的DFI mRNA-LNP处理后，其体重、转氨酶及肝功能均未出现显著变化，组织病理学检查也显示其出现比对照组更轻微的炎症反应（Extended Data Fig. 4g–l），也就是整体的不良反应较低；再之，注射mRNA的方法比直接注射重组蛋白的方法效果也更好，直接注射重组蛋白，很多炎症因子（如GM-CSF、IL-10、IL-12和IL-1β）的水平显著升高，所引发的系统性炎症风险更高(Supplementary Fig. 1h,i）。

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• Extended Fig4 G: 72-week小鼠在接受Luc（对照组）或DFI mRNA-LNPs注射后，28天内体重的变化情况，说明DFI注射对体重无影响
• Extended Fig4H: 72-week小鼠在接受DFI mRNA-LNPs注射后，血清肝功能指标（ALT、AST、ALP及胆红素）的变化情况，说明DFI注射对上述指标无影响
• Extended Fig4 I-J: NaCl及DFI mRNA-LNPs处理的老年小鼠肝脏切片的苏木精-伊红（H&E）染色与Masson三色染色代表图。（箭头表示有验证）
• Extended Fig4 K: 基于炎症、肝细胞变性及纤维化程度进行的肝脏病变组织病理学评分。DFI组这几个评分都不是很高，甚至有些指标还很低
• Extended Fig4 L: NaCl、Luc及DFI处理的老年小鼠在所有评估病理特征上的累积病理学总分。DFI组与其他组相近，表明其毒副作用低
• Supple Fig1H对经28天处理的72-week老年小鼠外周血进行多重细胞因子分析，表明直接注射重组蛋白，炎性因子表达量显著上升
• Supple Fig1I对经28天处理的72周龄老年小鼠外周血细胞因子浓度进行Z-score标准化展示