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首先设置Seurat对象

我们将从 分析10X 外周血单核细胞 （PBMC） 数据集。原始数据可以在这里找到。

读取数据。该函数从 10X 读取，返回独特的分子识别 （UMI） 计数矩阵。此矩阵中的值表示每个功能（即基因;行）在每个细胞（列）中检测到的分子数量。

我们接下来使用计数矩阵创建一个对象。

library(dplyr)
library(Seurat)
library(patchwork)
# Load the PBMC dataset
pbmc.data <- Read10X(data.dir = "../data/pbmc3k/filtered_gene_bc_matrices/hg19/")
# Initialize the Seurat object with the raw (non-normalized data).
pbmc <- CreateSeuratObject(counts = pbmc.data, project = "pbmc3k", min.cells = 3, min.features = 200)
pbmc
## An object of class Seurat 
## 13714 features across 2700 samples within 1 assay 
## Active assay: RNA (13714 features, 0 variable features)

标准预处理工作流程

以下步骤包括 Seurat 中 scRNA-seq 数据的标准预处理工作流程。包括基于 QC 指标的过滤、数据标准化和归一化，以及检测高变异基因的功能。

QC 和选择细胞以供进一步分析

Seurat 允许您轻松地探索 QC 指标，并根据任何用户定义的标准过滤细胞。常用的一些 QC 指标包括

• 在每个细胞中检测到的基因数量。
  • 低质量细胞或空液滴通常只有很少的基因
  • 细胞双倍或多胞可能表现出异常高的基因计数
• 同样，细胞内检测到的分子总数（与独特的基因密切相关）
• 读取该细胞中的线粒体基因组的百分比
  • 低质量/死细胞经常表现出广泛的线粒体污染
  • 我们使用PercentageFeatureSet()函数计算线粒体 QC 指标，该函数计算来自一组功能的计数百分比

# The [[ operator can add columns to object metadata. This is a great place to stash QC stats
pbmc[["percent.mt"]] <- PercentageFeatureSet(pbmc, pattern = "^MT-")

在下面的示例中，我们可视化 QC 指标，并使用这些指标来过滤细胞。

• 过滤具有UMI计数超过 2，500 或小于 200的细胞
• 过滤具有>5%线粒体的细胞

# Visualize QC metrics as a violin plot
VlnPlot(pbmc, features = c("nFeature_RNA", "nCount_RNA", "percent.mt"), ncol = 3)

image

# FeatureScatter is typically used to visualize feature-feature relationships, but can be used
# for anything calculated by the object, i.e. columns in object metadata, PC scores etc.

plot1 <- FeatureScatter(pbmc, feature1 = "nCount_RNA", feature2 = "percent.mt")
plot2 <- FeatureScatter(pbmc, feature1 = "nCount_RNA", feature2 = "nFeature_RNA")
plot1 + plot2

image

pbmc <- subset(pbmc, subset = nFeature_RNA > 200 & nFeature_RNA < 2500 & percent.mt < 5)

标准化数据

从数据集中删除不需要的细胞后，下一步是使数据标准化。默认情况下，我们采用全局标准化。

pbmc <- NormalizeData(pbmc)

高变异基因的选择

接下来，我们计算数据集中显示高变异的特征子集（即，它们在某些细胞中表达强烈，在另一些单元格中表达得很低）。在下游分析中关注这些基因有助于突出单细胞数据集中的生物信号。

默认情况下，我们使用每个数据集的 2，000 个基因。这些将用于下游分析，如 PCA。

pbmc <- FindVariableFeatures(pbmc, selection.method = "vst", nfeatures = 2000)

# Identify the 10 most highly variable genes
top10 <- head(VariableFeatures(pbmc), 10)

# plot variable features with and without labels
plot1 <- VariableFeaturePlot(pbmc)
plot2 <- LabelPoints(plot = plot1, points = top10, repel = TRUE)
plot1 + plot2

image

归一化数据

接下来，我们应用线性转换（"归一化"）ScaleData()继续处理数据集。目的是

• 改变每个基因的表达，使细胞的平均表达为0
• 缩放每个基因的表达，使细胞之间的方差为 1
  • 这一步骤在下游分析中具有同等的权重，因此高度表达的基因不会占主导地位
• 结果存储在pbmc[["RNA"]]@scale.data

all.genes <- rownames(pbmc)
pbmc <- ScaleData(pbmc, features = all.genes)

PCA分析

接下来，我们将在缩放数据上执行PCA。默认情况下，只有先前确定的可变功能用作输入，但如果您希望选择不同的子集，则可以使用参数进行定义。

pbmc <- RunPCA(pbmc, features = VariableFeatures(object = pbmc))

Seurat 提供了几个有用的方法来可视化定义 PCA 的单元格和功能，包括 ，[DimPlot()]，[DimHeatmap()]等

# Examine and visualize PCA results a few different ways
print(pbmc[["pca"]], dims = 1:5, nfeatures = 5)
## PC_ 1 
## Positive:  CST3, TYROBP, LST1, AIF1, FTL 
## Negative:  MALAT1, LTB, IL32, IL7R, CD2 
## PC_ 2 
## Positive:  CD79A, MS4A1, TCL1A, HLA-DQA1, HLA-DQB1 
## Negative:  NKG7, PRF1, CST7, GZMB, GZMA 
## PC_ 3 
## Positive:  HLA-DQA1, CD79A, CD79B, HLA-DQB1, HLA-DPB1 
## Negative:  PPBP, PF4, SDPR, SPARC, GNG11 
## PC_ 4 
## Positive:  HLA-DQA1, CD79B, CD79A, MS4A1, HLA-DQB1 
## Negative:  VIM, IL7R, S100A6, IL32, S100A8 
## PC_ 5 
## Positive:  GZMB, NKG7, S100A8, FGFBP2, GNLY 
## Negative:  LTB, IL7R, CKB, VIM, MS4A7

VizDimLoadings(pbmc, dims = 1:2, reduction = "pca")

image

DimPlot(pbmc, reduction = "pca")

image

特别是，它允许在数据集中轻松探索异质性的主要来源，并且在尝试决定将哪些 PC 用于进一步下游分析

DimHeatmap(pbmc, dims = 1, cells = 500, balanced = TRUE)

image

DimHeatmap(pbmc, dims = 1:15, cells = 500, balanced = TRUE)

image

确定数据集的"主成分个数"

Seurat 根据 PCA 分数对单元单元进行聚类，每台 PC 基本上代表一个"元结构"，该"元结构"将信息组合在相关功能集中。我们随机排列数据的子集（默认情况下为 1%）并重新运行 PCA，构建功能分数的"空分布"，并重复此过程。我们确定"重要"PC。

# NOTE: This process can take a long time for big datasets, comment out for expediency. More
# approximate techniques such as those implemented in ElbowPlot() can be used to reduce
# computation time
pbmc <- JackStraw(pbmc, num.replicate = 100)
pbmc <- ScoreJackStraw(pbmc, dims = 1:20)

JackStrawPlot()功能提供了一个可视化工具，用于将每个 PC 的 p 值分布与统一分布（虚线）进行比较。"重要"PC 将显示在虚线上方。

JackStrawPlot(pbmc, dims = 1:15)

image

另一种启发式方法生成"肘部图"：[ElbowPlot()]根据每个（函数）解释的方差百分比对原则组件进行排名。在此示例中，我们可以观察到 PC9-10 周围的"肘部"，表明大多数真实信号在前 10 个 PC 中被捕获。

ElbowPlot(pbmc)

image

我们在这里选择了 10 个，但这不是确定的。

将细胞聚类

Seurat 采用基于图形的聚类方法，简言之，这些方法将细胞嵌入到图形结构中，例如 K 最近的邻邻 （KNN） 图，在具有类似特征表达模式的单元之间绘制边缘，然后尝试将此图划分为高度互连的"集团"或"社区"。

与表象一样，我们首先根据 PCA 空间中的欧几里德距离构建 KNN 图，并根据当地社区的共享重叠（Jaccard 相似性）优化任意两个细胞之间的边缘权重。
接下来将 Louvain 算法（默认值）或 SLM 等模块化优化技术应用于迭代组细胞，以优化标准模块化功能。该函数实现此过程，并包含一个分辨率参数，该参数设置下游聚类的"数量"，增加值导致更多群集。我们发现，将此参数设置在 0.4-1.2 之间通常会为大约 3K 细胞的单细胞数据集提供良好的结果。对于较大的数据集，最佳分辨率通常会增加。

pbmc <- FindNeighbors(pbmc, dims = 1:10)
pbmc <- FindClusters(pbmc, resolution = 0.5)
## Modularity Optimizer version 1.3.0 by Ludo Waltman and Nees Jan van Eck
## 
## Number of nodes: 2638
## Number of edges: 95965
## 
## Running Louvain algorithm...
## Maximum modularity in 10 random starts: 0.8723
## Number of communities: 9
## Elapsed time: 0 seconds
# Look at cluster IDs of the first 5 cells
head(Idents(pbmc), 5)
## AAACATACAACCAC-1 AAACATTGAGCTAC-1 AAACATTGATCAGC-1 AAACCGTGCTTCCG-1 
##                2                3                2                1 
## AAACCGTGTATGCG-1 
##                6 
## Levels: 0 1 2 3 4 5 6 7 8

运行非线性降维（UMAP/tSNE）

Seurat 提供了多种非线性降维技术，如 tSNE 和 UMAP，以可视化和探索这些数据集。。

# If you haven't installed UMAP, you can do so via reticulate::py_install(packages =
# 'umap-learn')
pbmc <- RunUMAP(pbmc, dims = 1:10)

# note that you can set `label = TRUE` or use the LabelClusters function to help label
# individual clusters
DimPlot(pbmc, reduction = "umap")

image

此时，您可以保存对象，以便轻松加载，而无需重新运行上面执行的计算密集级步骤，或轻松与协作者共享。

saveRDS(pbmc, file = "../output/pbmc_tutorial.rds")

查找不同表达的marker

默认情况下，FindAllMarkers()与所有其他细胞相比，可识别单个群集的marker。 但您也可以测试组群相互对立，或针对所有亚群。

# find all markers of cluster 2
cluster2.markers <- FindMarkers(pbmc, ident.1 = 2, min.pct = 0.25)
head(cluster2.markers, n = 5)
##             p_val avg_log2FC pct.1 pct.2    p_val_adj
## IL32 2.593535e-91  1.2154360 0.949 0.466 3.556774e-87
## LTB  7.994465e-87  1.2828597 0.981 0.644 1.096361e-82
## CD3D 3.922451e-70  0.9359210 0.922 0.433 5.379250e-66
## IL7R 1.130870e-66  1.1776027 0.748 0.327 1.550876e-62
## LDHB 4.082189e-65  0.8837324 0.953 0.614 5.598314e-61

# find all markers distinguishing cluster 5 from clusters 0 and 3
cluster5.markers <- FindMarkers(pbmc, ident.1 = 5, ident.2 = c(0, 3), min.pct = 0.25)
head(cluster5.markers, n = 5)
##                       p_val avg_log2FC pct.1 pct.2     p_val_adj
## FCGR3A        2.150929e-209   4.267579 0.975 0.039 2.949784e-205
## IFITM3        6.103366e-199   3.877105 0.975 0.048 8.370156e-195
## CFD           8.891428e-198   3.411039 0.938 0.037 1.219370e-193
## CD68          2.374425e-194   3.014535 0.926 0.035 3.256286e-190
## RP11-290F20.3 9.308287e-191   2.722684 0.840 0.016 1.276538e-186
# find markers for every cluster compared to all remaining cells, report only the positive ones
pbmc.markers <- FindAllMarkers(pbmc, only.pos = TRUE, min.pct = 0.25, logfc.threshold = 0.25)
pbmc.markers %>% group_by(cluster) %>% top_n(n = 2, wt = avg_log2FC)
## # A tibble: 18 x 7
## # Groups:   cluster [9]
##        p_val avg_log2FC pct.1 pct.2 p_val_adj cluster gene    
##        <dbl>      <dbl> <dbl> <dbl>     <dbl> <fct>   <chr>   
##  1 1.74e-109       1.07 0.897 0.593 2.39e-105 0       LDHB    
##  2 1.17e- 83       1.33 0.435 0.108 1.60e- 79 0       CCR7    
##  3 0\.              5.57 0.996 0.215 0\.        1       S100A9  
##  4 0\.              5.48 0.975 0.121 0\.        1       S100A8  
##  5 7.99e- 87       1.28 0.981 0.644 1.10e- 82 2       LTB     
##  6 2.61e- 59       1.24 0.424 0.111 3.58e- 55 2       AQP3    
##  7 0\.              4.31 0.936 0.041 0\.        3       CD79A   
##  8 9.48e-271       3.59 0.622 0.022 1.30e-266 3       TCL1A   
##  9 1.17e-178       2.97 0.957 0.241 1.60e-174 4       CCL5    
## 10 4.93e-169       3.01 0.595 0.056 6.76e-165 4       GZMK    
## 11 3.51e-184       3.31 0.975 0.134 4.82e-180 5       FCGR3A  
## 12 2.03e-125       3.09 1     0.315 2.78e-121 5       LST1    
## 13 1.05e-265       4.89 0.986 0.071 1.44e-261 6       GZMB    
## 14 6.82e-175       4.92 0.958 0.135 9.36e-171 6       GNLY    
## 15 1.48e-220       3.87 0.812 0.011 2.03e-216 7       FCER1A  
## 16 1.67e- 21       2.87 1     0.513 2.28e- 17 7       HLA-DPB1
## 17 7.73e-200       7.24 1     0.01  1.06e-195 8       PF4     
## 18 3.68e-110       8.58 1     0.024 5.05e-106 8       PPBP

几个可视化marker表达的工具。

VlnPlot(pbmc, features = c("MS4A1", "CD79A"))

image

# you can plot raw counts as well
VlnPlot(pbmc, features = c("NKG7", "PF4"), slot = "counts", log = TRUE)

image

FeaturePlot(pbmc, features = c("MS4A1", "GNLY", "CD3E", "CD14", "FCER1A", "FCGR3A", "LYZ", "PPBP", 
    "CD8A"))

image

[DoHeatmap()](https://satijalab.org/seurat/reference/DoHeatmap.html) generates an expression heatmap for given cells and features. In this case, we are plotting the top 20 markers (or all markers if less than 20) for each cluster.

top10 <- pbmc.markers %>% group_by(cluster) %>% top_n(n = 10, wt = avg_log2FC)
DoHeatmap(pbmc, features = top10$gene) + NoLegend()

image

亚群重命名

我们可以使用marker来轻松地将聚类与已知的单元类型进行匹配：

Cluster ID Markers Cell Type
0 IL7R, CCR7 Naive CD4+ T
1 CD14, LYZ CD14+ Mono
2 IL7R, S100A4 Memory CD4+
3 MS4A1 B
4 CD8A CD8+ T
5 FCGR3A, MS4A7 FCGR3A+ Mono
6 GNLY, NKG7 NK
7 FCER1A, CST3 DC
8 PPBP Platelet

new.cluster.ids <- c("Naive CD4 T", "CD14+ Mono", "Memory CD4 T", "B", "CD8 T", "FCGR3A+ Mono", 
    "NK", "DC", "Platelet")
names(new.cluster.ids) <- levels(pbmc)
pbmc <- RenameIdents(pbmc, new.cluster.ids)
DimPlot(pbmc, reduction = "umap", label = TRUE, pt.size = 0.5) + NoLegend()

image

最后保存数据。

saveRDS(pbmc, file = "../output/pbmc3k_final.rds")