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2024/03/01 public in gut
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Objective: intraductal papillary mucinous neoplasm (IPMN) 中是否有微生物
Results:
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Fig1A：实验设计
Fig1B：展示处理原始数据过程中reads数目的变化，可以发现在去污染之后样本量都大大降低
Fig1C：这里作者想说明交叉污染的问题，设计了 不同样本同一个flow vs 不同样本不同flow（不同日期） vs 同一样本重复这样的比较，使用Aitchison distances来进行比较并发现在同一flow不同样本 vs 不同flow不同样本中有差异。这里想说明1、重复没有意义。2、信噪比低。
Fig1D：接下来作者比较了Alpha-diversity以及the Gini coefficient，这里涉及样本量不均衡问题，negative control只有14个，而samples有318个。作者采用了an iterative analytical approach pre-DECONTAM，每次从两组样本中各取5个进行比较，观察到所有三个生态参数的false discovery rate density peaks远大于 0.25，表明control和sample之间的 α 多样性没有统计学上的显着差异
Fig1E：对样本做了聚类，有颜色标注的细菌（family level）应该意思是只在samples中出现。（这一部分我觉得图例和results不是很明确，并不知道红色部分是啥，猜测是controls）
figure2
Fig2A: 对没有去污染的数据做了Pcoa（为啥对没有去污染的做呢？）。大多数囊液样本（以黑色表示）均在control组的 95% CI 范围内，表明与 DNA 背景相比，不存在明显的微生物组特征。然而，出现了一个单独的子簇，代表具有独特微生物信号的异常组。
Fig2B: 为了研究影响该亚组不同聚类的生态参数和临床特征，使用线性混合效应模型，以第一个 PCoA 坐标作为响应变量。结果显示具有独特微生物信号的样本与最近的内窥镜诊断程序（包括细针抽吸）相关或与黄疸病例相关，因此内窥镜逆行胰胆管造影（ERCP）与支架置入有关。
Fig2C:把2B中单独分离出来的样本设置为子族，与主簇中的样本相比，子簇中的样本在 DECONTAM 后表现出显着更高的reads数。
Fig2D:子族和主族进行了alpha多样性和Gini coefficient的比较，虽然 Shannon 或 Chao1 多样性没有差异，但表现出显着升高的Gini coefficient。
figure3
Fig3A: 比较子族和control之间的Gini coefficient，因为alpha多样性没有区别，但是基尼指数不同，所以作者认为即使是子族也没有独特的生物群落，但是基尼指数暗示子族含有特定的主导的细菌族类，pcoa其实也标注了各组的主导分类。
Fig3B：这里把基尼指数作为y轴，横轴是污染物（ture）和真正的菌（False），进一步标记是哪些class。
但是存在的问题是：为什么c图和b图的基尼指数范围不同？这里用到的是所有的样本还是子族的样本？
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Fig4A: 由于超低生物量的问题，可能有未检测到的菌。为了解决这个问题，作者将已知浓度的低生物量模拟群落（由 Truepera radiovictrix、Imtechella halotolerans 和 Allobacillus halotolerans 组成）引入到新的patients样本 (n=20) 和新的阴性对照 (n=5) 中。然后根据每个模拟细菌获得的读数数量对已测序的微生物 16S rRNA 基因进行标准化，从而推断绝对微生物丰度估计值。在这种情况下，没有观察到sample和control之间的绝对丰度存在统计差异，只有两个异常值与对照相比表现出更高的非掺入微生物含量的绝对丰度。
Fig4B: 参照之前为解决群体规模不平衡而采用的二次抽样方法，并用于统计分析潜在微生物组的 α 多样性，表明对照组和囊液之间的 Chao1 多样性、基尼系数或香农多样性没有显着差异。
Fig4C: 除了两个异常样本外，在PCoA 结果中samples和control分不开。
Fig4D: 两个异常值既没有更高的 Shannon 或 Chao1 多样性估计值，也没有更多的 ASV。相反，它们显示出显着更高的细菌载量和注释为Enterobacteriaceae 的优势（基尼系数）增加，以及通过污染测试的 ASV 数量更高。
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Fig5A: 虽然通过加入模拟菌落没有更新显著结果，但是有助于发现超低生物量的菌落，例如Acinetobacter baumannii, Chitinophagales sp, Fusobacteriaceae sp, Parabacteroides goldsteinii, Phocaeicola sp and Prevotella intermedia。作者猜测可能过去基于内窥镜程序的细菌污染，这些细菌无法在胰腺生态位中维持自身，可能会死亡，在样本的子集中留下可检测到的残留痕迹
Fig5B:只有一份样本显示出Citrobacter koseri的生长，经全长 16S rRNA 基因测序进行分类学证实，其数量超过 200 000 CFU/mL，表明存在细菌感染。但是总体而言，我们的队列中 ASV 比率较低（<10%）
因此，作者参照通常保留队列患病率超过 10% 的典型微生物组这一标准，所有的 ASV 都将被丢弃，因此表明疾病与特异性微生物组特征无关。
总结：
总体而言，利用这个研究队列中发现不存在具有临床意义的胰腺囊肿微生物组，因此需要探索其他原因来解释炎症在大多数患者早期囊肿和肿瘤发展中的作用。另外，作者建议在未来以微生物组为中心的研究中纳入阴性对照，特别是涉及低生物量的研究。这一建议背后的基本原理在于，采样和实验室环境中不同程度的 DNA 污染以及样品之间的交叉污染会在生物样品中产生明显但具有误导性的阳性微生物组信号。
data：
16S rRNA amplicon sequencing data，
338 cyst fluid samples(囊肿液) from 190 patients and 19 negative controls
the full length 16s rRNA for validation
值得学习的地方：
negative control的设置
不平衡样本的处理方式
超低生物量数据的处理
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