01.摘要
磷脂酶D（PLD）是一种重要的酶，广泛应用于磷脂衍生物的合成，尤其是磷脂酰丝氨酸（PS）的酶促合成。然而，PLD的广泛应用受到其低稳定性和催化活性的限制。为了克服这些问题，本文采用了一种基于计算辅助突变设计和系统聚类分析的综合策略，成功获得了一个高活性和高热稳定性的PLD突变体PLDM4。该突变体的半衰期从原始酶（PLD-WT）的3.7分钟延长至89.8分钟，酶活性则从42.7 U/mL提升至413.1 U/mL。
通过对PLDM4突变体的进一步研究，发现其在水-有机溶剂双相反应体系中的PS合成效率显著提高，最高可达119.1 g/L。此外，PLDM4还能够在多种食用油中成功催化PS的合成，产量约为19.8 g/L，表明其在构建食品级PLD催化反应系统中的应用潜力。
分子动力学模拟和分子对接分析表明，PLDM4通过多个关键突变（如E435G、V470I和L345M）增强了酶的结构稳定性和催化效率。突变通过优化底物结合口袋、提高底物结合能力、增强酶的疏水性等机制，有效地提高了PLD的热稳定性和催化活性。
这些结果不仅为PLD的理性设计提供了有效的策略，也为其在食品工业等领域的实际应用扩展了可能性。
02.引言
磷脂酰丝氨酸（PS）是一种重要的生物活性脂质，在多种生理功能中发挥着重要作用，尤其在脂质代谢和认知功能中具有关键性作用。研究表明，PS具有改善记忆、缓解脑疲劳、缓解抑郁症状、预防阿尔茨海默病等生理效益。临床研究表明，外源性PS能够有效穿越血脑屏障，并在人体内被高效吸收，因此其在保健食品和药物领域具有巨大的潜力。随着对PS功能的研究不断深入，PS的商业需求逐年增加，这使得其合成方法成为了食品和药物工业中的研究重点。
传统上，PS的生产通常通过提取天然来源或采用化学合成方法。然而，这些方法存在较高的成本、较低的产率和潜在的健康风险，从而限制了PS的广泛应用。近年来，研究者们开始探索利用生物酶催化的方式合成PS，其中磷脂酶D（PLD）被认为是最有效的酶之一。PLD能够通过转磷脂反应将磷脂酰胆碱（PC）中的磷脂酰基转移到醇（如L-丝氨酸）分子上，从而合成PS。
尽管PLD具有良好的催化性能，但其在实际应用中的广泛性受到其热稳定性和催化活性的限制。PLD的热稳定性差使得在高温反应过程中酶的活性迅速降低，影响了催化效率；而催化活性低则导致PS的合成效率不高，从而无法满足工业化生产的需求。因此，提升PLD的热稳定性和催化效率，成为了促进其工业化应用的关键问题。
近年来，随着蛋白质工程技术的进步，研究人员通过定向进化和理性设计的方法对PLD进行了优化。通过这些技术，研究者们已成功构建出若干种具有较高热稳定性和催化活性的PLD突变体。例如，TH-2PLD突变体在高温下表现出较强的稳定性；而PLD的理性设计方法则进一步提高了其催化效率。然而，尽管已有多项研究取得了成功，如何在增强PLD的热稳定性和催化活性的同时，避免过度工程化导致酶活性的丧失，仍然是一个亟待解决的问题。
在此背景下，本研究提出了一种基于计算辅助设计和多计算方法相结合的策略，以构建热稳定性和催化效率均优异的PLD突变体。通过这种方法，我们能够对PLD进行系统的突变设计，从而在提升其热稳定性的同时增强其催化性能。为了验证该策略的有效性，我们进一步将PLD突变体应用于PS的生物催化合成反应，评估其在不同反应体系中的催化效率。
本研究的目标是通过理性设计和工程化优化，克服传统PLD在工业应用中的限制，开发出具有高热稳定性和高催化效率的PLD突变体，并进一步探索其在食品工业中，特别是在PS合成过程中的应用潜力。
03.材料与方法
细菌株、质粒、化学试剂和培养条件
在本研究中，磷脂酶D（PLD）基因来自Streptomyces sp.，并通过Bacillus subtilis WB600表达系统进行高效表达。具体实验材料如下：
- 细菌株和质粒：使用Bacillus subtilis WB600细菌株，质粒为pMApld4-SPestA，该质粒包含PLD基因。
- 化学试剂：包括磷脂酰胆碱（PC）、L-丝氨酸（L-Ser）、磷酸盐缓冲液、Triton X-100、CaCl₂等试剂，所有试剂均为分析纯级别。
- 食用油：用于食用油体系中的油品为商业可得的食用油（如菜籽油、橄榄油等）。
培养条件：所有培养工作均在LB培养基中进行，培养条件为37°C，180 rpm震荡培养，以确保高效的PLD基因表达。
定点突变和PLD的纯化
定点突变：使用逆向聚合酶链反应（PCR）技术进行定点突变，通过设计特异性引物引入目标突变，使用pMApld4-SPestA作为模板。所有突变的PLD基因经过测序确认。
突变体的表达与纯化：突变体在Bacillus subtilis系统中表达，培养条件包括适当的温度和时间以确保高效表达。通过Ni-NTA亲和层析法纯化重组酶。
酶活性检测：酶活性采用酶联比色法测定，原理是通过PLD催化底物转化生成胆碱，之后加入过氧化物酶-胆碱氧化酶体系进行颜色反应，在505 nm处测量吸光度，间接计算酶活性。
分子建模与分子对接
结构建模：使用AlphaFold2软件对成熟的PLD蛋白进行三维结构建模，去除信号肽后得到的PLD结构用于后续分析。模型的可靠性通过Verify 3D方法进行验证。
突变体建模：使用PyMOL中的“mutate”功能，基于PLD的结构设计不同突变位点的结构模型。
分子对接：使用AutoDock Tools处理蛋白质和配体文件，并进行分子对接分析。PLD被视为刚性体，采用半柔性对接方法，设置46×46×46 ų的盒子，中心为PLD的活性位点。通过对20轮对接的结果进行评估，选择最佳的对接结构，并用于后续的分子动力学模拟。
基于多计算设计的单点突变
多计算工具：为改进PLD的热稳定性，使用了PROSS和FireProt 2.0等计算工具。PROSS结合进化信息和原子级的Rosetta建模，预测稳定性更强的突变位置；FireProt 2.0通过回溯共识分析、能量计算和祖先序列重建等方式，帮助识别稳定性提高的突变点。
HotSpot Wizard 3.0：通过该软件，研究人员能够选择合适的突变位置。该工具整合了19种预测工具和3个数据库，提供了4种不同的策略来选择突变位点。
PLD活性测定
酶活性测定：用酶联比色法测定PLD的酶活性。反应体系包括60 μL的底物溶液（含10 mg/mL PC、0.1% Triton X-100、15 mM CaCl₂和40 mM Tris-HCl，pH 7.5）和40 μL的酶样品。反应在60°C下孵育20分钟，反应终止后加入过氧化物酶-胆碱氧化酶体系，最终测量505 nm处的吸光度，计算酶活性。
特定活性与动力学参数测定
特定活性测定：通过使用BCA蛋白质定量试剂盒测定纯化酶的浓度，计算特定活性。
酶动力学参数
为了评估PLD-WT和突变体的催化效率，采用米氏动力学方法测定PLD对PC的酶动力学参数。通过不同浓度的底物（2-20 mM），计算Vmax、Km和kcat值，并利用Michaelis-Menten方程计算催化效率。
分子动力学模拟
使用GROMACS软件包和Charmm36力场，进行PLD-WT和PLDM4的分子动力学模拟。模拟将蛋白质结构放入TIP3P水盒中，施加周期性边界条件，然后进行能量最小化、NVT和NPT平衡模拟。最终的生产动力学模拟在300 K和1 atm条件下进行50 ns，模拟结果使用PyMOL和VMD软件进行可视化分析。
04.结果与讨论
突变体库设计与筛选
为了提高磷脂酶D（PLD）的稳定性和活性，研究者采用了多计算工具结合系统聚类分析的方法，设计了PLD的突变体库。首先，基于AlphaFold2获得了PLD的三维结构，并通过Ramachandran图对其结构进行验证。通过对PLD的催化机制和分子对接结果分析，将PLD蛋白分为两个区域：
底物口袋区域（Region I）：位于底物和活性中心附近的氨基酸残基。
非底物口袋区域（Region II）：与底物结合较远的其他氨基酸残基。
针对这两个区域进行了不同的突变策略：
底物口袋区域：主要通过突变增强PLD的催化活性。研究人员进行了定点突变，设计了20种突变体来增强酶的活性。
非底物口袋区域：通过突变增强PLD的热稳定性，以实现蛋白质的局部刚性和全局柔性之间的最佳平衡。利用PROSS和FireProt 2.0软件分析了15个突变位点，这些突变位点有助于提升PLD的稳定性。
这些突变体通过计算筛选和实验验证，找到了几种关键的突变位点，并根据这些突变位点进行了组合突变。
突变体的酶活性和热稳定性
实验表明，突变体的酶活性和热稳定性较PLD-WT（野生型）有显著提高。具体结果如下：
单点突变的筛选：在20种底物口袋区域的突变中，有7种突变（如Y128F、A165S、L345I等）表现出了显著的酶活性增强，部分突变体的活性提高了70%以上。例如，A165S突变体的活性达到了135.6 U/mL，是PLD-WT的3.17倍。
饱和突变：在A165、L345和Q386等突变位点上进行了饱和突变，并通过实验筛选出活性最强的突变体。这些突变体在酶活性上有了进一步提升，且突变A165S和Q386N依然保持了较高的酶活性。
热稳定性的提高：突变体的热稳定性也有显著提高。在50℃下，PLD-WT的活性大幅下降，而突变体如V470I和M360L在相同条件下能够保持较高的残余活性。例如，V470I突变体在50℃下经过15分钟后，活性保持约58.4%，而PLD-WT仅保持10.2%。
突变体的组合突变与筛选
在突变体筛选和热稳定性评估的基础上，研究人员进一步采用了组合突变的策略。通过K-means聚类分析，将10个突变位点分为三个组，分别进行组合突变：
Cluster 1：包括E435G、V470I等突变，组合后的突变体PLDM1表现出了显著的酶活性提升（122.1 U/mL）和较好的热稳定性（52.3%残余活性）。
Cluster 2：包括Y128F、G188S等突变，这些突变体在酶活性和稳定性上均表现较好。
Cluster 3：包括A165S、L345M等突变，这些突变体的酶活性进一步增强。
最终，通过多轮组合突变，研究者得到了最优的突变体PLDM4（E435G-V470I-A378S-L345M）。PLDM4表现出了显著的活性提升（413.1 U/mL），比PLD-WT提高了约8.68倍，且残余活性为87.6%。这表明该组合突变显著提高了PLD的催化效率和热稳定性，具有较强的应用潜力。
PLDM4的催化效率和热稳定性分析
酶活性：PLDM4的酶活性表现出8.2倍的增强，达到了4661.5 U/mg。这比PLD-WT的508.6 U/mg高出许多。不同突变体的kcat值表现出不同的趋势，PLDM4的kcat/Km值提高了3.2倍，说明其催化效率大大增强。
热稳定性：PLDM4在50℃下保持了约78.4%的初始活性，经过1小时后仍保持61.6%的活性，展现了良好的热稳定性。PLDM4的半衰期从PLD-WT的3.7分钟提高到了89.8分钟，提升了23.3倍。在40℃下，PLDM4的半衰期为97.1小时，远高于PLD-WT的0.8小时。这表明PLDM4在常用于PLD催化反应的温度下具有极佳的稳定性，具有很大的工业应用潜力。
PLDM4的有机溶剂耐受性
PLD催化的PS合成反应常在水-有机溶剂双相体系中进行，因此PLD对有机溶剂的耐受性对其应用至关重要。研究表明：
PLDM4对有机溶剂的耐受性：PLDM4在大多数有机溶剂中（如环戊烯基甲基醚（CPME）和丁基乙酸酯）保留了更高的酶活性，尤其是在CPME中，PLDM4的残余活性较PLD-WT更高。
对食用油的耐受性：PLDM4在多种食用油中也表现出较高的残余活性，特别是在茶籽油和菜籽油中，残余活性超过了90%。
这些结果表明，PLDM4在有机溶剂和食用油中的耐受性较高，为PLD催化的反应提供了更多的应用选择，特别是在食品工业中。
PS合成效率
研究还测试了PLD-WT和PLDM4在不同PC浓度下的PS合成效率：
在PC浓度为50-200 g/L的范围内，PLDM4表现出明显优于PLD-WT的PS转化率和产量。特别是在200 g/L PC浓度下，PLDM4的PS转化率为59.5%，产量为119.1 g/L，超过了之前文献报道的最高产量（97.2 g/L）。
这表明PLDM4在PS合成中的潜力，尤其是在工业化应用中的巨大优势。
05.结构特征与分子机制
为了深入理解PLDM4（最优突变体）在热稳定性和催化活性提高方面的分子机制，文章对PLD-WT和PLDM4的结构特征进行了详细分析，并使用了分子动力学模拟（MD）进一步验证了这些突变如何影响PLD的结构和功能。
突变位置与结构特征分析
突变位置：研究人员分析了PLD-WT和PLDM4之间的关键突变位点及其对结构的影响。主要突变位点包括：
E435G：这个突变发生在一个环状结构中，距离活性中心较远（大于20 Å）。
V470I：这个突变位于β-sheet区域，也远离活性中心（大于20 Å）。
L345M：这个突变位于接近底物的区域，距离活性中心较近（不到4 Å），因此可能对催化活性有重要影响。
A378S：也属于接近底物口袋的突变，可能影响底物的结合或催化效率。
这些突变位点都涉及到了PLD的疏水性和稳定性，通过这些突变，研究者能够优化PLD的结构，提高其催化活性和热稳定性。
PLDM4与PLD-WT的结构差异
通过分析PLDM4和PLD-WT的结构，研究者发现以下几方面的差异：
疏水性改变：突变（如E435G和V470I）引入了更强的疏水性，改变了酶的整体结构稳定性。特别是E435G和V470I的突变，使得酶的二级结构更加紧密，从而提升了PLD的热稳定性。
氨基酸侧链的改变：L345M和A378S等突变显著改变了酶的底物结合口袋的结构。这些突变使得底物结合更加高效，从而增强了催化活性。
在分子动力学模拟中，研究者发现，PLDM4在模拟过程中展示了较高的热稳定性，这表明这些结构变化有效地增强了酶的整体稳定性，使得其能够在较高温度下仍保持较好的活性。
分子对接与动力学模拟
分子对接分析：通过分子对接，研究者分析了PLD-WT和PLDM4在底物结合过程中的差异。PLD的催化机制是通过两个HxKxxxxD（HKD）基序形成对称的催化域，采用SN2型亲核替代反应：
第一步：一个HKD基序上的组氨酸（His）残基作为亲核试剂攻击底物（如磷脂酰胆碱PC），另一个HKD基序的组氨酸（His）提供质子给离去基团，形成磷脂酰酶中间体。
第二步：该中间体被接受醇（如L-丝氨酸（L-Ser））攻击，形成PS。
在分子对接中，PLDM4相比PLD-WT，底物与催化中心的结合更加稳定，这可能是由于突变导致的底物结合口袋结构的优化，减少了底物与酶之间的结合能。
分子动力学模拟（MD）：在MD模拟中，PLDM4的结构更为紧凑，整体结构的柔性和刚性得到更好的平衡。尤其是在高温条件下，PLDM4的结构保持了更高的稳定性，表现出比PLD-WT更长的半衰期。这表明突变增强了PLDM4的热稳定性，使其能够在工业应用中在高温下保持较好的催化效率。
热稳定性与催化活性的关系
通过对比PLD-WT和PLDM4的结构分析和分子动力学模拟，研究者得出以下结论：
结构稳定性：突变PLDM4后，蛋白质的整体结构稳定性增加，尤其是通过引入E435G和V470I突变，增强了酶的整体折叠稳定性，减少了蛋白质结构的动态变化，这为其在高温下的稳定性提供了保障。
催化活性提升：由于底物结合口袋的结构优化（如L345M突变），PLDM4的底物结合和转化效率得到了提高。结合能的降低和底物与催化中心的稳定结合，是PLDM4催化效率提高的关键因素。
分子机制的总结
PLDM4通过一系列的突变改变了其内部的疏水性、底物结合口袋的结构以及活性中心的稳定性，从而在提高热稳定性和催化活性方面发挥了重要作用。具体而言：
热稳定性增强：PLDM4突变体在高温下保持较高的残余活性，表明其在高温下的稳定性得到大幅度提高。
催化效率提升：突变体在底物结合口袋的改造和催化机制的优化下，显示出更高的催化效率，尤其在PS合成反应中的表现尤为突出。
PLDM4的结构优化和分子机制分析表明，通过多种突变位点的引入，PLD的热稳定性和催化效率都得到了显著增强。特别是通过分子动力学模拟和分子对接分析，研究者揭示了这些突变如何通过优化底物结合口袋的结构、增强酶的整体稳定性来提升PLD的性能。这些发现为未来PLD的工程化改造和工业化应用提供了重要的理论依据。
06.结论
本研究通过理性设计和蛋白质工程策略，成功构建了一个具有显著提高的热稳定性和催化活性的磷脂酶D（PLD）突变体（PLDM4），并验证了其在磷脂酰丝氨酸（PS）合成中的优异性能。主要结论如下：
PLDM4突变体的性能提升：PLDM4的半衰期从原始酶PLD-WT的3.7分钟显著延长至89.8分钟，酶活性从42.7 U/mL提高至413.1 U/mL。这表明通过突变设计，PLD的热稳定性和催化效率得到了显著提高。
PS合成效率提升：PLDM4在水-有机溶剂双相反应体系中的PS合成效率达到了119.1 g/L，而在多种食用油体系中也成功合成了PS，展示了其在实际工业应用中的潜力。
结构机制分析：分子动力学模拟和分子对接分析揭示了PLDM4突变体通过优化底物结合口袋和增强酶的稳定性，在热稳定性和催化效率方面获得了改善。特别是通过突变E435G、V470I和L345M，PLDM4突变体在高温下保持较高的酶活性。
应用潜力：PLDM4突变体表现出更强的有机溶剂和食用油耐受性，适用于工业规模的PS合成，尤其在食品工业中，具有广泛的应用前景。
07.创新点与启发
创新点
综合的计算辅助设计方法：本研究采用了多种计算工具（如PROSS、FireProt 2.0等）结合分子动力学模拟和分子对接分析，以系统化的方式优化PLD突变体。这种结合了结构、动力学模拟和实验验证的方法，展示了在理性设计蛋白质工程中的潜力。
增强的催化效率与热稳定性：研究中通过组合突变优化了PLD的催化活性和热稳定性，提出了一种改进酶性能的新策略，这为催化剂在高温环境中的应用提供了新的思路。
工业化应用的实际示范：研究不仅解决了PLD催化效率和热稳定性问题，还成功将该方法应用于PS的合成，展现了该PLD突变体在工业化生产中的应用潜力，尤其是在食品工业领域。
启发：
计算辅助蛋白质设计的应用：这篇文献通过使用多种计算工具来优化蛋白质的结构，增强了对蛋白质工程的理解。学习如何结合分子动力学模拟和结构对接分析，为设计更加高效的催化剂提供了新的视角。
系统化的多计算方法：研究中应用的多计算方法（如PROSS、FireProt 2.0等）和聚类分析提供了一个系统化的、结构驱动的突变设计策略。这种方法不仅限于PLD的设计，还可以推广到其他酶类和蛋白质的优化。
蛋白质工程与工业应用结合：文献通过优化PLD突变体并将其应用于PS合成，展示了蛋白质工程的实际应用价值。学习如何将实验室研究成果与实际工业需求对接，是科研工作的一个重要方向。
分子动力学模拟与酶催化机制结合：利用分子动力学模拟来揭示PLD突变体的催化机制，学习如何通过计算和模拟深入理解酶的功能，进而优化其性能。
