文章复现 | WGCNA算法识别肾透明细胞癌CD8T细胞浸润相关关键基因

前言：加权基因共表达网络分析（weighted gene co-expression network analysis，WGCNA）是研究相似基因表达模式的一种方法，通过寻找协同表达的基因模块，研究这些模块与临床表型之间的关系，并识别网络中的关键基因（Langfelder & Horvath, 2008）。普通的共表达网络分析，通过绝对的阈值对基因相关性进行筛选，将会导致一定的信息丢失，WGCNA通过引入加权的相关系数来更加全面的体现基因表达之间的相关性，发掘其中的生物学意义。我们拟对AGING上发表的“Identification of biomarkers related to CD8+ T cell infiltration with gene co-expression network in clear cell renal cell carcinoma”（Lin et al., 2020）文章进行结果重现。
具体实现过程如下：

1.1 数据获取

从GEO网站下载GSE73731数据，该数据中包括了265个ccRCC样本的测序数据。

1.2 数据预处理

###### 读入数据并进行矫正
### 加载R包，读入数据
library(GEOquery)
library(ggplot2)
library(reshape2)
library(limma)
options(stringsAsFactors=F)
gset <- getGEO(filename='GSE73731_series_matrix.txt',AnnotGPL=TRUE,destdir='./')
exp.mat <- exprs(gset)
sample.info.dat <- pData(gset)
gene.info.dat <- fData(gset)
# 查看样本间表达值分布，如图1所示
boxplot(exp.mat)
图1 样本间基因表达值分布.png
# 芯片间表达数据矫正
exp.norm.mat <- normalizeBetweenArrays(exp.mat)
### 去除没有基因symbol的探针
gene.filtered <- (!grepl("///", gene.info.dat[,"Gene symbol"])) & (gene.info.dat[,"Gene symbol"]!="")
gene.symbol.dat <- data.frame(GeneSymbol=gene.info.dat[gene.filtered,"Gene symbol"])
rownames(gene.symbol.dat) <- rownames(gene.info.dat)[gene.filtered]
exp.norm.mat <- exp.norm.mat[gene.filtered,]
### 对于对应相同基因symbol的多个探针，取各个探针的平均表达值
symbol.mean.list <- by(exp.norm.mat,gene.symbol.dat$GeneSymbol,colMeans)
symbol.mean.mat <- matrix(unlist(symbol.mean.list), byrow=T, ncol=ncol(exp.norm.mat))
rownames(symbol.mean.mat) <- names(symbol.mean.list)
colnames(symbol.mean.mat) <- names(symbol.mean.list[[1]])

# 查看矫正之后各个样本的表达分布，如图2所示，与图1相比，可看出芯片的批次效应得到矫正
exp.melt.dat <- melt(symbol.mean.mat,value.name="Expression")
colnames(exp.melt.dat)[1:2] <- c('Gene','Sample')
pdf('expression.mean.norm.pdf',width=60,height=5)
ggplot(exp.melt.dat,aes(x=Sample,y=Expression,fill=Sample)) + 
geom_boxplot() + 
theme(legend.position='none',axis.text.x = element_text(angle=45, hjust=1, vjust=0.5))
dev.off()
图2 矫正之后样本间基因表达值分布.png
# 计算基因变异系数（CV），根据CV>0.1取高变异基因进行下游分析
symbol.cv.vec <- apply(symbol.mean.mat,1,function(x){ sd(x)/mean(x) })
symbol.mean.filter.mat <- symbol.mean.mat[symbol.cv.vec > 0.1,]
symbol.mean.dat <- data.frame(symbol.mean.filter.mat)

1.3 WGCNA网络构建

###### 参照WGCNA教程，对265例ccRCC表达数据构建加权共表达网络
### 加载R包
library(WGCNA)
library(ggplot2)
library(reshape2)
library(limma)
library(plyr)
# 检查数据中是否有缺失值
datExpr <- t(symbol.mean.dat)
gsg <- goodSamplesGenes(datExpr, verbose = 3)
gsg$allOK
### 计算合适的相关系数软阈值，如图3所示，据此可选择3或4为相关性软阈值power
powers <- c(c(1:10), seq(from = 12, to=20, by=2))
sft <- pickSoftThreshold(datExpr, powerVector = powers, verbose = 5)

pdf(file = "Plots/SoftThreshold.pdf", width = 8, height = 4)
par(mfrow = c(1,2))
plot(sft$fitIndices[,1], -sign(sft$fitIndices[,3])*sft$fitIndices[,2], xlab="Soft Threshold (power)",ylab="Scale Free Topology Model Fit,signed R^2",type="n", main = paste("Scale independence"))
text(sft$fitIndices[,1], -sign(sft$fitIndices[,3])*sft$fitIndices[,2],labels=powers,cex=0.9,col="red")
abline(h=0.85,col="red")
plot(sft$fitIndices[,1], sft$fitIndices[,5], xlab="Soft Threshold (power)",ylab="Mean Connectivity", type="n", main = paste("Mean connectivity"))
text(sft$fitIndices[,1], sft$fitIndices[,5], labels=powers, cex=0.9,col="red")
dev.off()
图3 scale-free fit index (left) and average connectivity (right) of 1-20 soft threshold power.png
###### Step-by-step network construction
### 计算邻接矩阵与相异矩阵
adjacency <- adjacency(datExpr, power = sft$powerEstimate)
TOM <- TOMsimilarity(adjacency)
dissTOM <- 1-TOM
geneTree <- hclust(as.dist(dissTOM), method = "average")
### 使用动态剪切树算法鉴定相关模块
minModuleSize = 30
dynamicMods <- cutreeDynamic(dendro = geneTree, distM = dissTOM, deepSplit = 2, pamRespectsDendro = FALSE, minClusterSize = minModuleSize,cutHeight=0.99)
table(dynamicMods)
dynamicColors <- labels2colors(dynamicMods)
### 将相似的模块聚类，如图4所示
MEList <- moduleEigengenes(datExpr, colors = dynamicColors)
MEs <- MEList$eigengenes
MEDiss <- 1-cor(MEs)
METree <- hclust(as.dist(MEDiss), method = "average")
pdf(file = "Plots/cluster.module.step2.pdf", width = 8, height = 6)
plot(METree, main = "Clustering of module eigengenes", xlab = "", sub = "")
MEDissThres = 0.25
abline(h=MEDissThres, col = "red")
dev.off()
图4 模块间相似性聚类.png
### 将相似模块聚为一个模块，如图5所示，除灰色模块外，共鉴定到9个信息模块
merge <- mergeCloseModules(datExpr, dynamicColors, cutHeight = MEDissThres, verbose = 3)
mergedColors <- merge$colors
mergedMEs <- merge$newMEs
moduleColors <- mergedColors
pdf(file = "Plots/dendrogram.module.merged.step2.pdf", width = 8, height = 7)
plotDendroAndColors(geneTree, cbind(dynamicColors, mergedColors), c("Dynamic Tree Cut", "Merged dynamic"), dendroLabels = FALSE, hang = 0.03, addGuide = TRUE, guideHang = 0.05)
dev.off()
图5 基因模块聚类图.png

1.4 细胞成分计算

通过CIBERSORTx（Newman et al., 2019）对bulk测序样本中不同类型免疫细胞的成分进行推算，将265个ccRCC样本的表达矩阵上传至CIBERSORTx网站（https://cibersortx.stanford.edu/）进行在线计算。

1.5 T细胞浸润相关模块鉴定

### 数据读入与预处理
infil.t <- read.csv('CIBERSORTx_Job2_Results.csv',head=T,row.names=1)
infil.t <- infil.t[,grep('T.cells',colnames(infil.t))]
infil.t <- infil.t[colnames(symbol.mean.dat),]
datExpr = as.data.frame(t(symbol.mean.dat))
datTraits = infil.t
nGenes = ncol(datExpr)
nSamples = nrow(datExpr)
### 计算模块eigengene与免疫细胞浸润相关性
MEs0 <- moduleEigengenes(datExpr, mergedColors)$eigengenes
MEs <- orderMEs(MEs0)
moduleTraitCor <- cor(MEs, datTraits, use = "p")
moduleTraitPvalue <- corPvalueStudent(moduleTraitCor, nSamples)
### 相关图展示，如图6所示，可以看出绿色模块与CD8T细胞浸润之间存在显著相关，下面的分析中针对这一模块进行重点研究
textMatrix <- paste(signif(moduleTraitCor, 2), "\n(", signif(moduleTraitPvalue, 1), ")", sep = "")
dim(textMatrix) = dim(moduleTraitCor)
pdf('Plots/Module-trait-relationships.pdf',width=10,height=8)
labeledHeatmap(Matrix = moduleTraitCor,
    xLabels = names(datTraits),
    yLabels = names(MEs),ySymbols = names(MEs),
    colorLabels = FALSE,
    colors = blueWhiteRed(50),
    textMatrix = textMatrix,
    setStdMargins = FALSE,
    cex.text = 0.5,
    zlim = c(-1,1),
    main = paste("Module-trait relationships"))
dev.off()
图6 Module-trait relationships.png

1.6 鉴定hub gene

###### 根据gene significance（GS）和module membership（MM）鉴定具有重要作用的hub gene
### 计算MM
geneModuleMembership <- as.data.frame(cor(datExpr, MEs, use = "p"))
MMPvalue <- as.data.frame(corPvalueStudent(as.matrix(geneModuleMembership), nSamples))
modNames <- substring(names(MEs), 3)
names(geneModuleMembership) = paste("MM", modNames, sep="")
names(MMPvalue) = paste("p.MM", modNames, sep="")
### 计算GS
CD8T <- as.data.frame(datTraits$T.cells.CD8)
names(CD8T) <- "CD8T"
geneTraitSignificance <- as.data.frame(cor(datExpr, CD8T, use = "p"))
GSPvalue <- as.data.frame(corPvalueStudent(as.matrix(geneTraitSignificance), nSamples))
names(geneTraitSignificance) <- paste("GS.", names(CD8T), sep="")
names(GSPvalue) <- paste("p.GS.", names(CD8T), sep="")
### 查看绿色模块内部gene与CD8T细胞浸润的相关性（即GS值），以及与绿色模块eigengene相关性（即MM值）
### 如图7所示，这里我们根据GS>0.5且MM>0.8进行筛选，可以得到66个hub gene
module = "green"
column <- match(module, modNames)
moduleGenes <- moduleColors==module
pdf('Plots/MM-GS.green.pdf',width=7,height=7)
verboseScatterplot(abs(geneModuleMembership[moduleGenes, column]),
    abs(geneTraitSignificance[moduleGenes, 1]),
    xlab = paste("Module Membership in", module, "module"),
    ylab = "Gene significance for body weight",
    main = paste("Module membership vs. gene significance\n"),
    cex.main = 1.2, cex.lab = 1.2, cex.axis = 1.2, col = module)
dev.off()
图7 Module membership and gene significance in green module.png

1.7 结果汇总

# Summary output of network analysis results
geneInfo0 <- data.frame(GeneSymbol= names(datExpr),
    ModuleColor = moduleColors,
    geneTraitSignificance,
    GSPvalue)
# Order modules by their significance for CD8T
modOrder <- order(-abs(cor(MEs, CD8T, use = "p")));
# Add module membership information in the chosen order
for (mod in 1:ncol(geneModuleMembership))
{
oldNames <- names(geneInfo0)
geneInfo0 <- data.frame(geneInfo0, geneModuleMembership[, modOrder[mod]],
    MMPvalue[, modOrder[mod]])
names(geneInfo0) = c(oldNames, paste("MM.", modNames[modOrder[mod]], sep=""),paste("p.MM.", modNames[modOrder[mod]], sep=""))
}
# Order the genes in the geneInfo variable first by module color, then by geneTraitSignificance
geneOrder <- order(geneInfo0$ModuleColor, -abs(geneInfo0$GS.CD8T));
geneInfo <- geneInfo0[geneOrder, ]
write.csv(geneInfo, file = "Plots/geneInfo.csv")
write.csv(rownames(geneInfo)[geneInfo$ModuleColor=='green'], file = "Plots/geneInfo.green.csv",row.names=F)

# 自定义标准选择hub gene
############################################
geneInfo <- read.csv("Plots/geneInfo.csv",header=T,row.names=1)
gene.greenInfo <- geneInfo[geneInfo$ModuleColor=='green',1:6]
hub.gene.green <- rownames(gene.greenInfo)[(gene.greenInfo$GS.CD8T > 0.5) & (gene.greenInfo$MM.green > 0.8)]
write.csv(hub.gene.green,'hub.gene.green.csv')

主要参考文献：
Langfelder, P., & Horvath, S. (2008). WGCNA: an R package for weighted correlation network analysis. BMC bioinformatics, 9(1), 559.
Lin, J., Yu, M., Xu, X., Wang, Y., Xing, H., An, J., ... & Zhu, Y. (2020). Identification of biomarkers related to CD8+ T cell infiltration with gene co-expression network in clear cell renal cell carcinoma. Aging (Albany NY), 12(4), 3694.
Newman, A. M., Steen, C. B., Liu, C. L., Gentles, A. J., Chaudhuri, A. A., Scherer, F., ... & Diehn, M. (2019). Determining cell type abundance and expression from bulk tissues with digital cytometry. Nature biotechnology, 37(7), 773-782.

最后编辑于 ：
©著作权归作者所有,转载或内容合作请联系作者
  • 人面猴
    序言：七十年代末，一起剥皮案震惊了整个滨河市，随后出现的几起案子，更是在滨河造成了极大的恐慌，老刑警刘岩，带你破解...
    沈念sama阅读 213,099评论 6赞 492
  • 死咒
    序言：滨河连续发生了三起死亡事件，死亡现场离奇诡异，居然都是意外死亡，警方通过查阅死者的电脑和手机，发现死者居然都...
    沈念sama阅读 90,828评论 3赞 387
  • 救了他两次的神仙让他今天三更去死
    文/潘晓璐 我一进店门，熙熙楼的掌柜王于贵愁眉苦脸地迎上来，“玉大人，你说我怎么就摊上这事。” “怎么了？”我有些...
    开封第一讲书人阅读 158,540评论 0赞 348
  • 道士缉凶录：失踪的卖姜人
    文/不坏的土叔 我叫张陵，是天一观的道长。 经常有香客问我，道长，这世上最难降的妖魔是什么？ 我笑而不...
    开封第一讲书人阅读 56,848评论 1赞 285
  • 港岛之恋（遗憾婚礼）
    正文 为了忘掉前任，我火速办了婚礼，结果婚礼上，老公的妹妹穿的比我还像新娘。我一直安慰自己，他们只是感情好，可当我...
    茶点故事阅读 65,971评论 6赞 385
  • 恶毒庶女顶嫁案：这布局不是一般人想出来的
    文/花漫 我一把揭开白布。 她就那样静静地躺着，像睡着了一般。 火红的嫁衣衬着肌肤如雪。 梳的纹丝不乱的头发上，一...
    开封第一讲书人阅读 50,132评论 1赞 291
  • 城市分裂传说
    那天，我揣着相机与录音，去河边找鬼。 笑死，一个胖子当着我的面吹牛，可吹牛的内容都是我干的。 我是一名探鬼主播，决...
    沈念sama阅读 39,193评论 3赞 412
  • 双鸳鸯连环套：你想象不到人心有多黑
    文/苍兰香墨 我猛地睁开眼，长吁一口气：“原来是场噩梦啊……” “哼！你这毒妇竟也来了？” 一声冷哼从身侧响起，我...
    开封第一讲书人阅读 37,934评论 0赞 268
  • 万荣杀人案实录
    序言：老挝万荣一对情侣失踪，失踪者是张志新（化名）和其女友刘颖，没想到半个月后，有当地人在树林里发现了一具尸体，经...
    沈念sama阅读 44,376评论 1赞 303
  • 护林员之死
    正文 独居荒郊野岭守林人离奇死亡，尸身上长有42处带血的脓包…… 初始之章·张勋 以下内容为张勋视角 年9月15日...
    茶点故事阅读 36,687评论 2赞 327
  • 白月光启示录
    正文 我和宋清朗相恋三年，在试婚纱的时候发现自己被绿了。 大学时的朋友给我发了我未婚夫和他白月光在一起吃饭的照片。...
    茶点故事阅读 38,846评论 1赞 341
  • 活死人
    序言：一个原本活蹦乱跳的男人离奇死亡，死状恐怖，灵堂内的尸体忽然破棺而出，到底是诈尸还是另有隐情，我是刑警宁泽，带...
    沈念sama阅读 34,537评论 4赞 335
  • 日本核电站爆炸内幕
    正文 年R本政府宣布，位于F岛的核电站，受9级特大地震影响，放射性物质发生泄漏。R本人自食恶果不足惜，却给世界环境...
    茶点故事阅读 40,175评论 3赞 317
  • 男人毒药：我在死后第九天来索命
    文/蒙蒙 一、第九天 我趴在偏房一处隐蔽的房顶上张望。 院中可真热闹，春花似锦、人声如沸。这庄子的主人今日做“春日...
    开封第一讲书人阅读 30,887评论 0赞 21
  • 一桩弑父案，背后竟有这般阴谋
    文/苍兰香墨 我抬头看了看天上的太阳。三九已至，却和暖如春，着一层夹袄步出监牢的瞬间，已是汗流浃背。 一阵脚步声响...
    开封第一讲书人阅读 32,134评论 1赞 267
  • 情欲美人皮
    我被黑心中介骗来泰国打工， 没想到刚下飞机就差点儿被人妖公主榨干…… 1. 我叫王不留，地道东北人。 一个月前我还...
    沈念sama阅读 46,674评论 2赞 362
  • 代替公主和亲
    正文 我出身青楼，却偏偏与公主长得像，于是被迫代替她去往敌国和亲。 传闻我的和亲对象是个残疾皇子，可洞房花烛夜当晚...
    茶点故事阅读 43,741评论 2赞 351