不愧是汤大佬
TGS：Third-generation sequencing
基于第三代测序平台的单细胞测序技术。红色与绿色表示已经实现的检测，其中红色表示基于第三代测序平台比基于第二代测序平台的方法所具有的优势方面。
首先，基于 TGS 的 scRNA-seq 技术能够通过直接对全长完整的 cDNA 进行测序来检测选择性剪接或 DNA 重排。包括我们在内的一些研究最近开发了基于 TGS 的 scRNA 测序技术，包括 SCAN-seq，R2C2，ScISOR-Seq，ScNaUmi-seq 和 RAGE-seq。
- SCAN-seq 能够在单个小鼠胚胎干细胞(mESC)中检测到 > 8000个基因，对基于下一代测序(NGS)平台的 scRNA-seq 技术(例如 SMART-seq2和 SUper-seq)具有相似的敏感性。大量未注释的新的转录本能够被检测到。SCAN-seq 在小鼠植入前胚胎中检测到6487个未注释转录物，对应于3834个基因，27250个未注释转录物，对应于9338个基因。
- ScISOR-Seq 在小鼠小脑中检测到18173种已知亚型和16872种新亚型。
- 此外，RAGE-seq 已经显示了基于 TGS 的方法检测来自 T 细胞受体(TCR)和 B 细胞受体(BCR)转录物的体细胞 DNA 重排的融合转录物的能力。
其次，虽然使用基于 NGS 的短读取可以准确检测 SNV 和短插入缺失等小变异，但较大的结构变异(SVs)更难以检测和表征。为了提高 SV 检测的可靠性和分辨率，基于 TGS 的方法得到了迅速发展.我们小组最近开发了一种基于 TGS 的单细胞基因组测序技术 SMOOTH-seq
对于单个细胞，该技术获得平均长度为6kb 的长测序读数，并通过0.4倍测序深度达到19% 的基因组覆盖率。除了插入，缺失，重复和易位之外，该技术还有效地检测染色体外圆形 DNA (ecDNA) ，能够在一次读取中覆盖 < 10kb 的全长 DNA。
第三，单分子纳米孔测序能够直接检测表观遗传修饰，如5mC 和6mA。将这种能力与 N6-甲基腺苷(m6A)甲基转移酶或 GpC 甲基转移酶的酶可及性结合起来，三个研究小组最近报道了基于 TGS 的酶可及性技术，用于长距离沿单分子(SMAC-seq，fiberseq 和 nanNOMe)检测染色质状态。虽然这些方法尚未被应用于单细胞分析，但它们显示了 TGS 在研究大基因组区域内相邻调控元件状态之间的协调性方面的价值，为今后的研究开辟了新的途径。
High-throughput targeted long-read single cell sequencing reveals the clonal and transcriptional landscape of lymphocytes
高通量单细胞 RNA 测序是一项强大的技术，但只能从 cDNA 模板的一端产生短读数，限制了高度多样化序列的重建，如抗原受体。为了克服这一局限性，我们将 T 细胞受体(TCR)和 B 细胞受体(BCR) mRNA 转录物的靶向捕获和长读测序与通过基于液滴的分区产生的条形码单细胞文库的短读转录组分析结合起来。我们表明，通过测序的库和基因表达(RAGE-Seq)可以在核苷酸分辨率下产生准确的全长抗原受体序列，推断 B 细胞克隆进化并鉴定选择性剪接的 BCR 转录物。我们将 RAGE-Seq 应用于从乳腺癌患者的原发肿瘤和引流淋巴结取样的7138个细胞，以追踪扩增的淋巴细胞克隆在组织中的转录组特征。我们的研究结果表明，RAGE-Seq 是一种追踪大量淋巴细胞克隆进化的有效方法，适用于免疫、自身免疫和癌症研究。
