原代细胞作为直接来源于生物组织的细胞体系，因其较好地保留了体内原始的生理特性、遗传背景及功能状态，在基础研究、疾病模型构建及药物筛选等领域具有不可替代的价值。然而，在原代细胞中进行基因功能研究时，尤其是通过小干扰RNA（siRNA）实现基因沉默，其转染效率往往远低于永生化细胞系，成为制约实验成功的关键瓶颈。
本文将系统分析原代细胞难以转染的内在原因，评述传统转染试剂在原代细胞转染应用中的局限性，并重点介绍基于可降解生物纳米材料的新型siRNA转染试剂在原代细胞中实现高效转染的优势，以期为相关研究提供理想的技术选择。
一、原代细胞难以转染的内在机制与原因
原代细胞转染困难主要源于其固有的生物学特性，大体有以下四点：
（1）与经过长期体外适应、增殖活跃的永生化细胞系不同，原代细胞通常处于有丝分裂不活跃或缓慢的状态，这种低增殖率一定程度上限制了其转染效率。
（2）原代细胞对外界刺激非常敏感，其膜结构和内环境稳定性较差，对传统转染过程中引入的物理或化学扰动耐受性低，易引发应激反应甚至凋亡。
（3）原代细胞种类繁多，不同类型细胞在膜组成、电荷特性、内吞效率及内体逃逸能力等方面存在显著异质性，缺乏一种普适性强的标准化转染方案。
（4）原代细胞获取不易、数量有限且存活时间短，要求转染试剂必须具备高效、低毒的作用特点，这进一步增加了技术难度。
二、传统转染试剂的局限：阳离子脂质体与PEI的毒性与强电荷困境
面对原代细胞转染的挑战，目前商业化的转染试剂大多基于阳离子脂质体（如Lipofectamine 2000、Lipofectamine3000等）或聚乙烯亚胺（PEI）等高分子聚合物。这些试剂虽在多种细胞系中表现出色，但其用于原代细胞时却存在明显缺陷。具体而言，阳离子脂质体通过正电荷与核酸结合并吸附于带负电的细胞膜，通过膜融合或内吞作用进入细胞。然而，其强烈的正电荷特性易破坏细胞膜完整性，干扰膜电位，并可能引发显著的细胞毒性，导致原代细胞存活率急剧下降。类似地，PEI虽能高效压缩核酸形成复合物并通过“质子海绵效应”促进内体逃逸，但其非降解性及高电荷密度会导致细胞内代谢负担加重、活性氧累积，并可能诱发炎症反应，对脆弱原代细胞的生理状态造成不可逆损害。因此，尽管这些试剂在转染机制上具有一定效力，但其固有的生物毒性严重限制了它们在原代细胞研究中的应用，迫使研究者需在转染效率与细胞活力之间做出艰难权衡。
其次，阳离子脂质体或PEI这类成分在研发之初目的是转染质粒这种大分子，为了能够与质粒形成转染复合物就必须带有很强的正电荷，然而这种强电荷对于siRNA转染来说并不具备优势。siRNA通常仅有21bp左右，当这种小分子遇到强电荷的载体时虽然会快速形成转染复合物，但也由于电荷强度太大的原因而导致小分子核酸被吸附的很紧密，因此很难在胞浆内得到充分释放，这也是为什么很多研究者发现Lipofectamine 2000、Lipofectamine3000转染siRNA时明明转染阳性率很高、荧光很强（其实是荧光团聚），但基因沉默效率却并不理想的原因。
综合两方面来看，传统转染试剂对于原代细胞的siRNA转染还存在较大的局限性，并不是研究者进行原代细胞RNAi研究的最佳选择。
三、新型转染试剂的破局：可降解生物纳米材料的创新优势
要想摆脱这样的困境，研究者的目光就不能只盯着传统转染试剂，一些采用新型可降解生物纳米材料作为递送载体的siRNA转染试剂比如RFectPMV2，已被多项研究证明可高效进行原代细胞（如单核细胞、心肌细胞、周细胞、小胶质细胞、内皮细胞等）的siRNA转染。与传统的阳离子脂质体或PEI不同，RFectPM V2的这种研发材料具备优异的细胞膜亲和特性和极低的细胞毒性：一方面，该材料经过化学修饰，添加了亲和原代细胞膜的基团，可显著提高对原代细胞的siRNA转染效率，并最大程度避免对细胞膜造成损伤，从而大幅减少了由转染试剂本身引起的细胞应激与毒性。另一方面，当递送载体将siRNA递送入原代细胞胞浆后，载体自身就可迅速降解为无毒或低毒的小分子代谢产物，不仅避免了像传统转染试剂那样由于不可降解而长期在胞内积累带来的副作用，还能在完成核酸递送使命后及时清除，最大限度地维持了原代细胞的正常代谢与功能。
以下是我们实验室使用RFectPMV2原代细胞siRNA转染试剂转染原代大鼠平滑肌细胞的荧光图、明场图以及基因沉默效率。荧光显微镜下观察发现，RFectPMV2转染FAM-NC到该细胞中转染阳性率超90%；细胞死亡率仅5%左右，与正常培养的空白对照组细胞死亡率基本一致。RT-qPCR检测结果显示，相比于NC组，实验组中转染了对原代大鼠平滑肌细胞中单链DNA结合蛋白SSB基因的siRNA后，其相对mRNA表达水平可被敲降90%以上。
