1. Author
Pradeep D Uchil目前在耶鲁大学病原微生物系工作。Pradeep从事病毒学、免疫学和细胞生物学的研究。他们目前的项目是“TRIM蛋白和逆转录病毒免疫学对先天免疫的调节”。随着新冠的爆发，Pradeep团队也进行了了诸多关于SARS-CoV-2的研究，例如：新冠肺炎恢复期血浆的抗体Fc段功能对小鼠SARS-CoV-2治疗效果的影响等，并且试图探求基于细胞外膜囊泡（OMV）疫苗的免疫原性和临床前疗效。
2. Background
2.1 SARS-CoV-2 NTD结构域
SARS-CoV-2刺突蛋白——S蛋白是打开细胞大门的钥匙，抗体与刺突蛋白结合来保护机体免受感染。从SARS病毒得到启发，人们对研究靶向刺突蛋白的受体结合结构域（RBD）的抗体给予了很多关注。（刺突蛋白RBD负责触发这种病毒与宿主细胞的融合，从而实现对后者的接管）。然而，来自康复患者的一些抗体通过与病毒刺突蛋白上的另一个地方——N末端结构域（N-terminal domain, NTD）——结合来阻断这种病毒。在 MERS 冠状病毒中，靶向 NTD 表位的中和单克隆抗体7D10 通过空间位阻阻止RBD 与其细胞受体 DPP4 结合。有趣的是，在SARS-CoV-2 中，一种单克隆抗体4A8直接与 NTD 相互作用，而不阻断 RBD-ACE2 的结合，但仍表现出中和作用。最近，在 S 蛋白的 D614G 变体中，检测到明显的 NTD 运动伴随着 RBD 的构象变化。这些研究表明，NTD 至少并非完全独立于 S 蛋白中RBD 的功能构象改变，因此可能参与了病毒感染的调控。
2.2 K18-hACE2 小鼠模型
在2003-2004年SARS流行期间，由于受感染的小鼠只产生了轻微的疾病，美国爱荷华大学的研究人员和其他人构建出表达hACE2的转基因小鼠（即K18-hACE2小鼠）。K18-hACE2小鼠在细胞角蛋白18编码基因的启动子的驱动下表达hACE2，而且主要是在上皮细胞中表达。SARS-CoV-2和SARS-CoV都使用hACE2，但在患者的疾病表现中显示出差异。SARS-CoV-2感染上呼吸道的程度比SARS-CoV更大。SARS-CoV-2已经与嗅觉丧失、味觉丧失、血栓形成和肺血管内皮损伤、心脏和神经系统疾病以及儿童和青少年中的多系统炎症等临床表现相关。
3. Methods
1. 生物发光成像（BLI）
2. 病毒负荷的测量
3. ELISA
4. 炎症因子的mRNA分析
5. 蛋白表达纯化
6. 流式细胞术
7. SPR（表面等离子共振）
8. 假病毒中和测试
9. 微量中和试验
10. Fc功能段测试
11. 冷冻电镜
4. Results
众所周知抗体发挥功能的方式大致可以分为两类：中和与Fc介导的细胞功能。已经有大量的文献报道了中和能力较强的抗体。那么发挥着Fc段功能的抗体是否也能抗病毒呢？实验团队对这一科学问题进行了研究。
首先他们从处于恢复期（CV）的病人取外周血，并以S蛋白2P作为探针，筛选出了27个单克隆抗体，其中的CV3-13是一个无中和的抗体。CV3-13可以和新冠诸多突变株有较高的亲和力，并且针对S-6-P这个蛋白的亲和力最高。除此之外根据不同亚基结合力测试发现，NTD有可能是CV3-13的潜在位点。
同时，因为CV3-13已经证明是非中和抗体，但又位于筛选的名单之中，试探团队就推测CV3-13通过Fc段介导细胞作用发挥功能（ADCC、ADCP等）。
结合上述实验结果，已经证明了CV3-13是一个NTD靶向的非中和抗体，实验团队想通过结构生物学的手段直观分析二者的结合模式。通过冷冻电镜图得到诸多信息：① CV3-13互补决定区H3、L1、L3参与了大部分的抗原识别。②NTD的结构域中，根据残基位置命名了1-5，5个环（loop），这5个环参与了CV3-13 Fab段的稳定。③CV3-13上CDRH3与NTD中的N3-N4环、N2-N3环相互作用。④ CV3-13与N2、N4和埋藏的N2-3发夹(残基95-102)形成广泛接触，这一情况很少出现在NTD靶向的抗体中。 ⑤CV3-13的CDR H3酪氨酸与N3的Tyr144-Tyr145相互作用是结合的关键位点，而该位点在新冠突变株（如B.1.1.7）就发生了突变，使得CV3-13的抗病毒作用明显降低。
紧接着作者把CV3-13同其他NTD靶向的抗体进行了结构比较，发现在结合的模式上有着明显的不同。普通NTD靶向抗体的结合位点为NTD supersite——NTD超位点。 CV3-13靶标在离病毒膜表面较近的刺突外侧区域，该区域与NTD supersite仅有略微重叠。同时正如上文提及，CV3-13与N2-3发夹、N2-4环的接触是非常新颖的发现，在其他NTD靶向的抗体中从未发现。而突变株对CV3-13的免疫逃逸也预示着N3的Tyr144-Tyr145是一个重要的非中和抗体的表位，这与之前认知的“N3-N5环为重要的靶点”有着明显的偏差。、
为了从结构的角度更好的了解抗体识别以及CV3-13的作用角度如何影响作用方式，作者团队进一步对结构进行分析。据报道以NTD supersite为靶点的抗体是从spike蛋白的顶部开始接触而感染增强位点（infectivity-enhancingsite ）的接触是从底部开始的。CV3-13则介于二者之间，这使得CV3-13可以发挥Fc段的细胞作用。同时作者指出NTD中的环状结构是抗体接触的重要因素。
当已经得到了分子与细胞层面的东西以后，作者团队开始从较为宏观的角度研究CV3-13的抗病毒作用。他们发现在小鼠实验中，CV3-13并没有起到一个很好的预防病毒的作用，所以他们认为除了Fc介导的免疫细胞清除外，Fab段的中和也起到了至关重要的作用。当发现这样的问题以后，作者团队提出了一个想法：利用GASDALIE突变（可以增强抗体Fc段与效应细胞的结合能力）来增强CV3-13的抗病毒作用。在比较突变和野生型之后发现从体重、病毒扩散能力、NTD的mRNA表达水平各个维度考量，突变型都起到了良好的抗病毒作用。那这种良好的抗病毒作用是否能延缓新冠小鼠的死亡呢？为了知道这一点，实验团队延长了实验终点以评估生存。发现CV3-13确实能起到良好的作用。到此为止作者团队已经就抗体Fc段进行了良好的改造，但为了得到性能更加良好的抗体，实验团队还试图增强Fab段的功能，即绑定一个中和性抗体：CV3-25。其中有趣的一点是CV3-13的GASDALIE突变增强了ADCC的功能，而CV3-25的LALA突变抑制了ADCC的功能，当二者1：1融合以后总的趋势还是增强ADCC。同时，当用CV3-13 GASDALIE和CV3-25 LALA的1:1组合预处理小鼠时，我们无法通过BLI检测到nLuc信号，这表明病毒复制被完全抑制。因此当二者融合以后，生成了一个具有良好抗病毒作用的新抗体！
