今天分享最近发在MP上的一篇杨树茎的空间转录组文章。该研究论文主要回答了植物学领域争论了120年的科学问题：即植物的次生维管组织发育过程中，韧皮部细胞和木质部细胞是来源于一个共同的干细胞中心，还是分别来源于两个干细胞中心？

因为我对别人这个实验设计和科学问题不太了解，对维管发育也知之甚少，看introduction看的也是似是而非。下面是别人的详细科学问题介绍：

植物维管组织（Vascular tissue）是植物体内负责物质运输与机械支撑的组织系统，是植物由水生向陆生长期演化过程形成的重要组织类型，相当于动物体内血管与骨骼组织的功能。一年生草本植物的维管组织主要是初生维管组织系统，是由初生分生组织原形成层干细胞与其子细胞分化形成的初生韧皮部与初生木质部组成。而多年生的木本植物在初生原形成层干细胞形成的初生维管组织的基础上，进一步演化形成了次生分生组织——维管形成层。

关于维管形成层是由一层还是多层干细胞组成的，也是植物学领域内争论了120年的科学问题。目前有两种主要的观点：德国植物学家Sanio在1873年提出了维管形成层干细胞是由一层干细胞组成的假说：维管形成层区域中有一层具有双向分裂能力的干细胞，即向外侧分裂形成韧皮部母细胞，向内分裂形成木质部母细胞 (Sanio, 1873)，因此形成层区域内是由三种细胞类型组成：韧皮部母细胞，形成层干细胞和木质部母细胞，这个观点目前被教科书普遍采用。

植物学家Raatz在1892年提出维管形成层干细胞可能由多层细胞组成的理论猜想(Raatz, 1892) 。由此进一步衍生的科学问题是：1）初生的原形成层干细胞是如何逐步分化产生次生的维管形成层干细胞？2）原形成层是如何与维管形成层协同调控茎的高生长与加粗生长的过程的？3）次生维管组织发育过程中，韧皮部细胞和木质部细胞是来源于一个共同的干细胞中心，还是分别来源于两个干细胞中心？在此之前，对这些科学问题知之甚少。

=====实验设计======

首先，作者通过连续电镜切片的观察发现，茎从初生生长到次生生长的连续发育过程中，茎顶端的原形成层干细胞衍生的子细胞在韧皮部（离心方向）和形成层（向心方向）两个组织区域中，分别形成了形态差异显著的两类次生分生组织干细胞群。

在韧皮部中的干细胞群，细胞形态特征与原形成层干细胞类似，具有细胞分裂能力，负责韧皮部细胞的形成；在维管形成层区域的干细胞群，由已知的形成层纺锤状原始细胞和射线原始细胞组成，负责木质部细胞的形成（见下图）。（当然，作者如果不用箭头highlight一下，以我的知识背景，是看不出来这不同的细胞类型的）

============实验结果===========

1. 构建了杨树茎从初生生长到次生生长连续发育过程的空间转录组

作者运用空间转录组学方法，分析了杨树茎从初生生长到次生生长连续发育过程中，把SA, IN1, IN2放在了一个切片上，IN3 IN5, IN7放在了一个切片上。最终第一个切片上获得了2006个spots，第二个切片获得了2345个spots。最终结果可以分成17个类，这个17个类又可以分成2个大部分：初生相关的cluster，以及次生相关的cluster（下图A），而这些初生和次生的cluster在空间位置上，也是和SA, IN1, IN2, IN3, IN5, IN7高度吻合的（下图C），从而说明作者对于不同cluster注释的准确性。紧接着，作者鉴定了每个cluster 特异表达的marker 基因，对于marker基因又进行了不同cluster之间的venn分析，GO注释分析等，从而从基因和功能的角度去解释了不同细胞类型的差异和特异性。

2. 初级分生组织分化成初级维管组织

从电镜切片的结果来看，初生组织主要包含原形成层干细胞（PC），然后分化成了初生韧皮部，初生木质部，形成层干细胞（MC）。所以作者C1 cluster，也就是初生维管组织，单独拿出来进行了细分（上图B），可以进一步的分为6个子类（PC-a，PC-b，PPh-a，PPh-b，PXy，MC），6个子类的空间分布如上图D所示。每个cluster的marker基因如下图A和B所示，有已知的，也有新的可能的regulators。紧接着，作者highlight讲了很多个不同sub-cluster的marker基因。

3. 次生维管组织里面发现了2种类型的分生组织干细胞

在电镜切片中，作者也发现了次生维管组织里面有2种类型的分生组织干细胞。所以基于空转数据，作者单独把cluster 11和14拿出来做了进一步的细分聚类。C14可以继续细分为2小类：一类是PCL，一类是DPh。C11可以细分为：CZ和DXy。相关的marker基因如上图所示。从而再次确认了：两类次生分生组织干细胞群分别位于韧皮部和维管形成层两个组织区域中。

4. 杨树次生维管组织单细胞数据和空转数据的比较

然后作者，利用以前发表的杨树次生维管组织的单细胞数据（类似于这个文章中的IN5和IN7）和他们的空转数据进行了对比。发现单细胞数据里面的细胞，比如phloem mother cell（C6）和phloem companion cells（C13）都比对到了空转数据中的IN3,IN5和IN7。而像xylem mother cells（C5）和xylem fibers（C4）则比对到了次生木质部的区域。从而在一定程度上反应了本研究空转数据的准确性。然后，作者又对两组数据的marker基因进行了对比。

5. 次生维管组织中2种类型的分生组织干细胞的验证

对于，前面鉴定的2类分生组织干细胞中的marker基因，作者进一步采用原位杂交实验和自身启动子驱动的GFP转基因杨树材料，验证了两类干细胞群表达的特征表达基因在次生维管组织中的表达模式。

6. 从初生到次生分生组织的转录变化

基于空转数据，作者接着查看了从初生到次生分生组织的轨迹变化。因为我还看不到附图。但是从文中描述来说，也是常规分析，选取了C1.0, 14.0, C1.4, C11.0来做了拟时序分析。鉴定了在轨迹变化过程中起重要作用的功能基因，分别进行了功能富集方面的阐述。

7/8. 从初生分生组织到次生韧皮部（木质部）的转录变化 （其实6,7,8做的分析类似，只不过面向的科学问题不一样而已）

和上个结果类似，对于韧皮部，选取的是C1.0, C1.3, C1.2, C1.5 C14.0, C14.1, C12做的拟时序分析（下图A, B，C）。对于木质部，选取的是C1.0, C1.3, C1.4, C11.0, C11.1, C8做的拟时序分析。

然后根据拟时序过程中起关键作用的基因，根据表达pattern，分成了几类，画了几类表达的特征（下图D,J），highlight了几个关键基因（F, L）。

9. 次生维管组织发育的基因表达pattern

然后作者根据不同次生维管组织的分类和相应基因的表达pattern，尝试去鉴定不同次生维管组织类型特异表达的基因。主要highlight4类：a) meristem identity; b) phloem identity; c) xylem identity; and d) secondary cell wall deposition。相关的重要特异基因以及他们的表达如下图所示：

最后，作者总结了作者从初生分生组织干细胞到次生分生组织干细胞分化过程中的基因表达规律；以及两类次生维管组织干细胞分别分化形成韧皮部细胞与木质部细胞过程中的基因表达规律。以及从初生到次生维管组织发育的新模型。