Review of Single-Cell RNA Sequencing in the Heart
导读：单细胞RNA测序(scRNA-seq)技术是一种强大的，快速发展的工具，用于表征单个细胞和阐明细胞水平的生物学机制。心血管疾病是世界范围内的主要死亡原因之一，其确切的病理机制尚不清楚。scRNA-seq为健康和病态心脏提供了许多新的见解。在这篇综述中，研究人员总结了各种scRNA-seq平台，并描述了通过scRNA-seq分析揭示的心血管发展和疾病的分子机制。接着，研究人员描述了scRNA-seq的最新技术进展。最后讨论了如何利用scRNA-seq技术将基础研究转化为临床医学。
论文ID
原名：Review of Single-Cell RNA Sequencing in the Heart
译名：单细胞RNA测序在心脏中的综述
期刊：Int. J. Mol. Sci
IF：4.556
发表时间：20201106
通讯研究人员：Seitaro Nomura
通讯研究人员单位：东京大学医学院心血管医学系
DOI号：10.3390/ijms21218345
实验设计
介绍
下图总结了本文的内容。作者首先介绍适用于每种细胞类型的scRNA-seq平台。接下来，作者描述了scRNA-seq分析揭示的心血管发展和疾病的分子机制。然后，作者介绍了scRNA-seq的最新技术进展。最后，作者讨论了如何利用scRNA-seq将基础研究转化为临床医学
结果
2.1针对小细胞的平台
IFC（整合液体循环）
分选细胞进入腔室in a more automated manner. Cells are automatically lysed, and cDNA libraries are quickly prepared for sequencing. IFC captures cells less than 25 μm in diameter and processes up to 800 cells. FACS and IFC are platebased platforms, and thus the number of cells that can be sorted and analyzed is limit
Both Drop-seq [5] and Chromium (10× Genomics), which is a commercial droplet-based platform allow for the rapid profiling of thousands of individual cells by encapsulating them in tiny droplets, adding barcodes to each cell’s RNAs, and sequencing them together. a microflfluidics device to perform droplet separation; therefore, the size of cells that can be analyzed is generally less than 30 µm in diameter.（所以成年心肌细胞用小细胞平台没法分离）
评判单细胞转录组测序的一种方法以及平台的选择需要考虑：检测基因的能力检测细胞数量的能力
液滴基于的系统（500-1500基因，多细胞） 板基于的系统（1000-4000基因，少细胞），板和液滴均适合于小和正常的细胞
2.2针对大细胞
有人尝试FACS with a larger nozzle size (130µm) to perform scRNA-seq of adult murine CMs 。. ICELL8（拥有成像系统，能可视化纳米孔，可以看出纳米孔中是单细胞还是多细胞；死细胞还是活细胞）
Manual pick-up and mouth pipettes （配合显微镜用，挑出来，以最佳的形态进行测序---这就要求技术人员很熟练与这样通量可能就会比较低）
由于检测成年心肌细胞的平台少，并且具有的基于板的检测平台通量也低，所以目前针对于成年心肌细胞多用核检测。
3. scRNA-seq and Cardiovascular Development and Disease
3.1鼠胚胎与新生小鼠心脏（相较于成年心脏，新生CM的优点：细胞外基质柔软；小；体外活力强）
scRNA-seq of CMs from murine embryonic or neonatal hearts have been performed using IFC, FACS, and a mouth pipette or droplet systems.
scRNA-seq has revealed some key factors in CM maturation。两个团队运用IFC系统获得了数千个...，他们揭示了与表明Nkx2.5。Xiong等利用FACS发现Nkx2-5直接调控第二心场趋化因子受体Cxcr2和Cxcr4的空间表达，以时空精度引导第二心场心脏祖细胞迁移。除了Nkx2-5，Mesp1 is also essential for CM maturation. 胚胎心脏祖细胞的scRNA-seq显示Mesp1是退出多能状态和诱导心血管基因表达程序所必需的
scRNA-seq还揭示了心脏发育并不只发生在心肌细胞内。后面介绍利用什么平台，测序什么发生上皮细胞与间充质细胞也能发生作用。（关键影响因子在心脏形成中的作用），低通量描述了一些机制。高通量探索也发现一些影响心脏发育的相关因子。-Hand2；病理与生理状况下心脏发育的分析。Gdf15的转录组激活
最近，心脏特定的区域也被单细胞转录组测序研究了。谁谁谁运用了什么平台探究了哪个阶段小鼠的区域。因此，在心脏发育过程中，每个区域的独特表达基因和表达变化被鉴定出来。
总结，发现了影响心肌细胞成熟的因子与心脏发育过程中，CM本身的变化。最后阐述了单细胞转录组测序的作用。scRNA-seq analysis research addressing these complex questions are expected.
3.2成年鼠心脏
新生胚胎心脏用于研究心脏发育和分化，成年心脏用于研究鼠疾病模型的病理形成。(MI)(I/R) (TAC)。成年CMs易受冲击，对pH和钙离子浓度敏感，长轴直径较大(>100 m);因此，与胚胎或新生儿CMs相比，它们更难分离和分选。一些平台已得到改进，允许成年CM的scRNA-seq，并揭示了疾病模型中的一些关键机制和反应。scRNA seq发现损伤时成纤维细胞激活，CM无增殖。这些发现表明可通过控制成纤维细胞激活来预防心肌梗死后过度纤维化的可能性以及加速CM增殖的难度。
TAC：压力过大 心功能 心衰机制 什么导致了CM异质性信号，可能是intrinsic (e.g., p53) and extrinsic signals
区域特定性Marker
细胞核测序的优点：1.去线粒体基因；2.小可以运用多种单细胞转录组平台检测 （单核RNA seq与单细胞RNA seq比较的文章看一下 3.细胞类型分辨率 4.转录组灵敏度
4.scRNA-seq and Applications
4.1 细胞与细胞互作 配体受体网络 CellPhoneDB
4.2 空间转录组 荧光测序原位杂交 （基于mRNA原位杂交技术）
成像细胞术去分析281例乳腺癌患者171,288个细胞中35个蛋白的定位
心脏空间基因表达（Some studies have investigated spatial gene expression in the heart. For example, Satoh et al. spatially quantifified gene expression at the single-cell level in the heart after TAC and found spatially heterogenous Myh7 expression in CMs after TAC。（学一下，人家段落展开的表达）心梗后不同区域影响心梗修复。因此，了解每个区域的转录组变化将导致新的治疗目标的MI。
4.3轨迹分析 时间评估也是单细胞分析的另一个重要因素。在发育或疾病进展过程中，基因表达的时间变化是必不可少的。分析时序性基因表达变化的方法主要有两种:基于scRNA-seq的细胞轨迹预测(称为轨迹推断);利用DNA条形码的谱系和整合每个细胞的转录组(谱系追踪)。
Trajectory inference interprets a single cell as a snapshot of a continuous process and reconstructs the pseudotime by analyzing transcriptional changes between neighboring cells
轨迹推断将单个细胞解释为连续过程的快照，并通过分析相邻细胞之间的转录变化重建伪时间。。轨迹推断方法：, such as Monocle [52], Wanderlust [53], Slingshot [54], and PAGA [55], have been developed.这些方法的不同之处在于模型路径的复杂性，它们是简单的线性轨迹、分岔轨迹或多分岔轨迹。Velocyto是一个软件包，通过区分未剪接和剪接的mrna，从估计RNA速度分析表达动力学。
谱系追踪：插入barcode到分裂之前的目细胞基因组DNA。目前心脏领域无用此方法，使用scRNA-seq分析的谱系追踪有可能揭示心脏细胞转变的精确机制
轨迹推断：（目前在心脏研究中主要用轨迹推断）
[if !supportLists]5. [endif]展望
作者先陈述了单细胞转录组在疾病与健康心脏中提供的新见解以及在疾病形成和心脏发育过程中的作用。接着描述了目前单细胞转录组以高时间和空间准确度的分子水平的研究，而非单纯的细胞水平的研究。（总说)
另外，临床数据与scRNA测序的结合在其他疾病中的研究流行。作者先介绍了两例结合单细胞与临床测序数据在其他领域的研究及发现。接着描述了一例在患有心肌病的心肌细胞中研究以及发现。
与其他器官一样，将scRNA-seq与心脏的临床数据联系起来有可能带来新的见解和治疗方法。要实现这一目标，必须将基础研究转化为临床医学。（总说）
