该综述中包括了 279 项研究衰老对生理小鼠模型中生殖器官、组织和细胞的生殖过程的影响。本文按生殖终点组织了文献综述，从内分泌和卵巢功能到卵母细胞和卵子动力学、受精和胚胎发育以及妊娠和分娩结局。在这里，我们总结了生殖系统、器官、组织和细胞的正常生理学，为审查生殖衰老的表型特征、在整个生殖系统和其他器官中保守的衰老标志以及生殖衰老独有的机制提供了见解。
女性生殖轴是最早衰老的器官系统之一，这对生育能力和整体健康产生了影响。在这里，我们基于广泛使用的生理衰老小鼠模型，提供了一个全面的女性生殖衰老生物学过程的综述，涵盖了生殖器官、组织和细胞，并描述了支撑这些表型的机制。总体而言，衰老与下丘脑-垂体-卵巢轴的功能失调、卵巢基质的扰动、卵子数量和质量的下降以及子宫形态和功能的改变相关，这些都导致了受精能力的下降和胚胎发育受损。最终，这些与年龄相关的表型会影响怀孕结果，并对后代产生不良后果。衰老的保守机制，以及那些特有的生殖系统机制，支撑了这些表型。了解这些机制将有助于开发延长女性生殖寿命、支持内分泌功能和整体健康的治疗方法。
女性生殖系统是最早衰老的人类器官系统之一；女性的生育能力在三十多岁时开始下降，且在更年期时生殖功能完全停止。此外，女性生殖衰老对整体健康有影响，因为内分泌功能的丧失增加了患心血管疾病、骨质疏松症、免疫衰老和神经退行性疾病的风险。女性生殖衰老对社会也有影响，表现为推迟生育和经历与年龄相关的不孕症。尽管全球平均预期寿命在增加，但更年期的平均年龄保持相对稳定；因此，经历更年期的人们在改变的内分泌环境中生活得更长。理解女性生殖衰老的机制对于改善生殖结果并支持全球一半人口的健康寿命至关重要。
非哺乳动物模型，包括果蝇、秀丽隐杆线虫和非洲爪蟾，在揭示与年龄相关的配子质量下降、生殖功能衰退和胚胎发生受损的分子机制方面发挥了重要作用。然而，由于这些模型与人类缺乏生理相似性，因此通过它们得出的结论并不总是具有临床相关性。尽管也使用人类和非人类灵长类动物样本来研究生殖衰老，但它们难以获取和进行实验操作，而且具有异质性。相比之下，啮齿动物模型寿命较短，操作简便，且展现出与人类相似的生理特征，因此非常适合用于转化研究。
常用的鼠类模型用于研究生殖衰老，包括生理衰老模型，其中小鼠经历自然衰老过程；手术模型，其中切除卵巢组织；以及一些治疗方法，如4-乙烯基环己烯二环氧化物（用于耗竭卵巢小体）、有害生殖细胞的化疗药物和辐射治疗。还有一些遗传小鼠模型，通过突变改变卵泡发育或激素生产。尽管常见的实验室小鼠品系并未完全重现人类生殖衰老的所有方面（主要是缺乏月经，从而也缺乏更年期），但它们确实表现出了生殖过渡和随年龄递减的生殖功能。
尽管月经丧失是人类生殖衰老的一个重要临床标志，但仅通过更年期来定义生殖生命周期的结束是有限的。因此，有必要改变哺乳动物年龄相关生殖衰退的定义，将其称为“卵巢衰退”（oopause），即排卵的永久性停止。通过这种方式进行比较时，小鼠在卵巢衰退后度过的时间与人类相似，这支持了小鼠作为生殖衰老研究重要模型的有效性。对哺乳动物模型（包括啮齿动物和非人类灵长类动物）的比较揭示了生殖衰老的保守表型和机制。
本综述聚焦于生理性衰老小鼠模型，旨在定义在生殖功能逐渐衰退过程中发生的关键生物学过程和机制，特别是指在生殖功能停止之前的这一时期，该时期模拟了人类的围绝经期。文献搜索所使用的标准以及关于小鼠在生殖上定义为年轻或年老的年龄、品系、产仔情况和体重等关键信息，在补充信息、补充表格1–6和补充图1–3中进行了总结。生殖生理学终点的年龄依赖性变化从内分泌和卵巢功能到卵母细胞和卵子动态、受精与胚胎发育、以及妊娠和分娩结果进行阐述。相关的正常生理过程在补充图4中进行了描述，以提供年龄相关变化的背景。本文总结了生殖衰老的特征（图1a），强调了在生殖组织和体细胞组织中保守的衰老标志物，并识别了独特的生殖衰老机制（图1b和图2）。这些知识为提出假设、研究机制以及进一步探索人类生殖衰老提供了机会，也为治疗和干预的开发提供了方向。
内分泌功能
激素动态变化
随着年龄的增长，小鼠会经历下丘脑-垂体-卵巢（HPO）轴的功能紊乱（图1a和补充图4a）。生育衰老的小鼠具有较高的促卵泡激素（FSH）水平，这在一定程度上是由于卵巢的类固醇反馈控制丧失，卵巢经历了与年龄相关的卵泡丧失。随着卵泡数量的减少，抑制素水平也会下降，FSH的负反馈作用丧失。血浆FSH水平在中年时开始上升，而此时卵巢储备——卵巢中的未成熟原始卵泡数量——仍然充足，表明年龄相关的FSH升高并非仅仅由于卵泡丧失。实际上，随着年龄的增长，下丘脑和垂体也失去了对卵巢分泌雌激素的反应能力；这种对雌激素反应性的丧失也促进了FSH水平的上升。随着年龄的增加，基础的黄体生成素（LH）水平以及LH高峰期的血浆LH浓度都会受到抑制，催乳素水平也是如此。
尽管小鼠进入无发情期的过渡过程具有异质性，但衰老小鼠的血清雌二醇和孕酮水平通常与去卵巢小鼠相匹配。衰老小鼠的血清睾酮水平在现有文献中没有描述。传统的类固醇激素测量方法包括免疫分析法，但由于抗体表位与非特异性背景之间的交叉反应，这些方法缺乏特异性，并且会导致激素水平的夸大。液相色谱‒质谱（LC–MS）技术的进步使得能够在低容量样本中准确测量类固醇激素和生物合成中间体，但这一技术尚未应用于整个生殖衰老过程的研究。
类固醇激素，如雌二醇、孕酮和睾酮，是由胆固醇合成的。催化类固醇激素合成的3β-羟类固醇脱氢酶的浓度和活性在衰老卵巢中减少。然而，卵巢中的总胆固醇含量随着年龄的增长而增加，外源性促性腺激素刺激能够恢复3β-羟类固醇脱氢酶的活性，这反映了在这些小鼠中胆固醇转化为性激素的过程存在与年龄相关的缺陷。
抗穆勒管激素（AMH）是由生长卵泡中的颗粒细胞产生的蛋白质激素，随着年龄的增长，它的水平下降，这主要是由于卵巢储备的耗竭，而不是表达下调。总体而言，由于衰老小鼠中细胞间通讯的改变，HPO轴的反馈调节和类固醇生成受到显著影响，导致内分泌状态不理想，从而改变了发情周期（图2）。
下丘脑-垂体卵巢轴 在小鼠和人类中，下丘脑-垂体-卵巢 （HPO） 轴在动态反馈回路中协调激素的产生和释放，以调节生殖功能。促性腺激素释放激素 （GnRH） 由下丘脑以搏动方式释放，驱动垂体分泌促性腺激素、卵泡刺激素 （FSH） 和黄体生成素 （LH）。FSH 诱导卵巢卵泡及其封闭的卵母细胞生长以及颗粒细胞产生雌二醇。生长卵泡中的雌二醇在正反馈回路中驱动垂体进一步产生 FSH。颗粒细胞也产生蛋白质激素抑制素，抑制垂体产生卵泡刺激素。随着抑制素水平的持续上升和雌激素的峰值，卵泡刺激素水平开始下降，垂体产生大量的黄体生成素，导致人类的单个卵子或小鼠的多个卵子排卵。排卵后，残留的卵泡经历黄体化形成黄体，黄体产生黄体酮，黄体酮作用于子宫，使子宫内膜增厚，为受精卵的着床做准备。如果植入没有发生，人体内的子宫内膜上皮脱落或小鼠体内的子宫内膜被重新吸收，循环往复。这个周期在人类中持续28天，在小鼠中缩短到4-5天，这使它们成为生殖研究特别有用的模型（补充图4a）。
小鼠的发情周期分为四个阶段：发情前期（ proestrus ）、发情期（ estrus ）、发情后期（ metestrus ）和退情期（ diestrus ）。发情前期通常与人类月经周期的卵泡中期相对应，此时卵泡刺激素上升促进卵泡生长和雌二醇合成。在发情前期结束时，抑制素增加，黄体生成素激增诱导排卵，导致雌二醇减少。发情期和发情后期平行于排卵后的黄体期，此时黄体酮水平较高，而退情期对应于黄体晚期/卵泡早期，此时黄体酮下降，雌激素开始上升。小鼠的动情周期可以通过阴道细胞学来追踪，比较三种细胞类型的相对丰度：白细胞、有核上皮细胞和角化上皮细胞。
发情周期
尽管随着年龄的增长，发情周期的规律性会受到影响，但特定的变化依赖于品系。总体而言，随着年龄的增加，正常发情周期的次数减少，周期长度增加，这通常是由于持续的黄体后期和排卵后期，或是延长的发情前期导致未能进入发情期。发情前期的高峰期雌二醇（E2）延迟以及整个周期中孕酮（P4）水平降低，会导致E2:P4比值失衡，从而延迟发情并加剧下丘脑-垂体-卵巢（HPO）轴功能障碍。随着年龄的增长，一些品系会在周期停止后出现持续的阴道角质化（PVC），并进入持续的黄体后期状态。对于年轻的发情周期正常的小鼠，阴道上皮细胞的增殖和分化是由雌激素驱动的。发情期的上皮细胞角质化是由于发情前期雌二醇升高引起的，并且是小鼠对交配有接受能力的阶段。在生殖年龄已过的老年小鼠中，PVC发生在没有发情周期的情况下，表明阴道上皮细胞的分化独立于雌激素的刺激。PVC持续的长度与周期停止的年龄成反比；早期停止发情周期的小鼠，PVC会持续更长时间，反之亦然。正常的发情周期性可以独立于生育状态持续；一些研究发现，小鼠在停止繁殖后仍能保持正常的发情周期。这些研究还发现，表现出较长正常发情周期的小鼠往往具有更长的寿命，表明完整的HPO轴对寿命的重要性。
卵巢及卵巢微环境
卵巢或女性性腺有两个主要功能：1） 支持女性配子的发育，以及 2） 产生和释放激素以响应刺激。卵巢卵泡是卵巢的功能单位，每个卵泡由一个卵母细胞组成，卵母细胞周围环绕着支撑颗粒和卵泡膜细胞。原始卵泡池是在胎儿发育过程中建立的，在女性的一生中没有得到补充；小鼠也是如此。在每个周期中（无论是人类的月经周期还是小鼠的发情周期），一群被激活的卵泡经历卵子发生和卵泡发生，最终产生一个（人类）或多个（小鼠）成熟的卵子，这些卵子可以排卵和受精。卵泡周围是卵巢间质，由免疫细胞、血液和淋巴管、神经、细胞外基质（ECM）和其他支持卵巢功能的成分组成（补充图4b）。卵泡发生和黄体生成的过程对于类固醇性激素的合成也是必不可少的，类固醇性激素驱动卵母细胞发育和排卵，并确保受精卵的成功着床。
卵泡动力学
卵巢卵泡是卵巢的功能单位，每个卵泡由一个卵母细胞和围绕它的颗粒细胞及卵巢膜细胞组成（补充图4b）。原始卵泡池或卵巢储备是在胎儿发育过程中建立的，并且无法再生；因此，它是女性生育寿命的一个标志（图1）。出生时卵泡的总数和卵泡消耗的速度与品系相关依赖。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）–PTEN–Akt信号通路调控原始卵泡的激活和生长，该通路中蛋白质的磷酸化水平增加，包括哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）和蛋白激酶B（Akt），与原始卵泡的激活相关。防止卵泡激活和卵泡萎缩有助于保存卵巢储备。最近，有研究提出，原始卵泡的随机激活和出生时原始卵泡的过剩供应是一个严格调控的过程，旨在确保卵泡的持续供应并维护卵巢功能。
mTOR复合物在响应激素、生长因子、细胞因子、氧气水平和包括氨基酸在内的营养物质时调节生长和代谢，是衰老过程中的关键角色。使用小分子抑制剂雷帕霉素（或其类似物）抑制mTOR复合物可延长整体寿命并延缓与年龄相关的疾病，目前对于这种药物在年龄相关不育方面的潜力也存在关注。短期使用雷帕霉素抑制mTORC1的老鼠表现出卵巢储备的保持和卵母细胞质量的改善。然而，鉴于在治疗过程中观察到暂时性不育和发情周期的停止，仍需要更多的安全性和有效性研究。通过热量限制，营养摄入与生殖衰老之间的关系也得到了探讨，热量限制导致暂时的不育，随后延长了生殖寿命。这些发现表明，饮食的影响可能比单纯的热量摄入更为复杂，并且可能依赖于蛋白质和支链氨基酸的组成。此外，卵泡池的消耗与Hippo信号通路的衰老相关变化有关，Hippo信号通路是一个进化上保守的途径，在调节细胞增殖和细胞命运方面发挥着核心作用，这些过程也涉及到原始卵泡的激活。
除了卵巢储备较低外，生殖老化的小鼠与年轻小鼠相比，生长中的卵泡数也更少。这些卵泡在生长过程中表现出年龄依赖性的紊乱，来自老鼠的二级卵泡中的卵母细胞较大，而这些二级卵泡与年轻小鼠中的相似卵泡相比卵母细胞较小。此外，生长中的卵泡随着年龄的增长表达更高水平的炎症基因，这最终可能影响卵子质量。
衰老的卵巢及其卵泡表现出线粒体功能障碍（见图2）。线粒体是母系遗传的细胞器，负责细胞呼吸和能量生产。在生殖老化小鼠的卵泡发生过程中，卵母细胞中的线粒体定位、数量和大小发生了紊乱。与年轻小鼠相比，衰老小鼠在初级卵泡阶段的卵母细胞相对于卵母细胞胞质区的线粒体数量减少，但在其他卵泡阶段则没有这种变化。在线粒体的形态学上，线粒体由内膜折叠成嵴，内膜包含呼吸复合物I–IV，构成电子传递链（ETC），并被外膜包围。当电子通过每个复合物传递时，会形成化学梯度，推动ATP的生成。来自电子传递链的电子泄漏可以产生活性氧（ROS），它们积聚并导致细胞和组织损伤。随着年龄的增长，卵巢中的ROS水平增加，导致卵泡细胞和卵巢表面上皮（OSE）中的脂质、蛋白质和DNA的氧化损伤。此外，卵巢中抗氧化剂的水平以及对抗ROS和ROS引起的损伤的蛋白质表达也随着年龄的增长而减少，增加了对氧化损伤的易感性。
参与ATP生产的电子载体包括还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）、黄素腺嘌呤二核苷酸（FADH2）和辅酶Q10（CoQ10）。CoQ10是一种具有抗氧化特性的必需酶，能够将与NADH或FADH2偶联的电子沿电子传递链（ETC）转运。此外，CoQ10还参与呼吸复合物的组装和稳定性，这对最小化ROS的生成至关重要。CoQ10的生物合成涉及由四聚体十碳二烯基二磷酸合成酶转化甲羟戊酸，并通过CoQ基因编码的多种酶的活性完成。随着年龄的增长，卵巢中负责CoQ10合成的酶（如PDSS2和COQ6）的表达减少。年轻雌性卵母细胞中的CoQ10缺乏与线粒体活性低下和染色体错位相关。CoQ10补充可以改善与年龄相关的线粒体功能障碍。甲羟戊酸途径是一种代谢途径，负责合成甾醇和异戊二烯类化合物，对卵母细胞成熟至关重要。随着年龄增长，该途径在颗粒细胞中的表达下调，导致减数分裂缺陷。此外，维持细胞中NAD+和NADH的可用性对氧化还原过程非常重要，而其减少可能导致线粒体代谢受损并增加氧化应激。
排卵、卵巢上皮和卵巢囊肿
在LH激增的反应下，卵子从窦卵泡释放到输卵管中，而卵泡的残余细胞则经历黄体化，形成黄体（CLs），并产生孕酮（见补充图4b）。与年轻小鼠相比，繁殖老化的小鼠每个周期排出的卵子较少，且黄体数量较少。除此之外，老年小鼠的排卵失败发生率较高，表现为卵巢中含有被困在未破裂黄体化卵泡中的卵母细胞，以及含有完全扩展的卵丘–卵母细胞复合体（COCs）的无排卵卵泡。排卵受损可能部分由于与年龄相关的纤维化；对老年小鼠使用抗纤维化药物可以增加排卵的卵子数量。年轻小鼠和老年小鼠的黄体在结构上也有所不同。与年轻小鼠的黄体相比，老年小鼠的黄体具有更大的横截面积和增加的细胞质肥大。来自繁殖老化小鼠的黄体血管化较差，周围有更多的胶原质，并且包含类淀粉样沉积物。
LH激增通过产生广泛的细胞外基质（ECM）触发卵丘细胞层的扩展（见补充图4b）。卵丘扩展对于最佳排卵和成功受精至关重要。随着生殖年龄的增长，卵丘扩展和COC的ECM完整性受到损害，部分原因是透明质酸（HA）水平的降低（见图1）。在封闭的定时影像系统下监测时，COC表现出特征性的扩展动力学模式，而衰老与这些形态动力学参数的特定品种变化相关。COC扩展受损可能是衰老过程中观察到的排卵缺陷的原因之一。
在卵泡破裂部位，卵巢上皮（OSE）被破坏，排卵后会修复（见补充图4b）。年轻小鼠的OSE由单层扁平细胞组成，但随着年龄增长，OSE表现出显著的增生。老年小鼠的OSE常常出现向卵巢基质内的内陷、脱落（即OSE从下方的卵巢组织中脱离）和异常的乳头状增生。这些与年龄相关的形态学差异可能是由于mTOR信号过度活跃所致，因为在生殖年龄较大的小鼠中，基因和药理学抑制mTOR信号通路能够有效减少OSE增生和乳头状增生。排卵诱导后，来自老年小鼠卵巢的OSE相较于年轻对照组，表现出细胞增殖和凋亡减少以及伤口愈合反应受损。
卵巢囊肿的来源不明确，且随着生殖年龄的增加而增多。卵巢上皮（OSE）与年龄相关的内陷可能导致卵巢内包涵囊肿，这些囊肿可以表现为良性的浆液性囊腺瘤，或引发上皮性卵巢癌。然而，大多数与年龄相关的卵巢囊肿与卵巢门相连，提示它们可能源自网状卵巢（rete ovarii），这是中肾管的残余结构。网状卵巢在生殖年龄较大的小鼠中出现扩张，通常在卵巢内形成囊性空间。随着年龄的增长，网状卵巢管道可能表现为增生性和/或肥大的上皮，同时伴有乳头状突起，但研究对于这些是否为卵巢上皮肿瘤的来源存在相互矛盾的结果。卵巢囊肿的存在具有高度的品系依赖性。例如，常用于模拟自身免疫疾病的MRL/MpJ品系常常出现卵巢囊肿，而C57BL/6小鼠则没有。未来的研究需要进一步明确卵巢囊肿是否与一生中的总排卵次数有关，因为相关研究结果存在矛盾。
卵巢微环境
卵泡被基质所包围，基质由成纤维细胞、免疫细胞、血管和淋巴管、神经、细胞外基质（ECM）及其他成分组成（补充图4b）。随着年龄的增长，卵巢微环境因Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白的积累而变得纤维化。卵巢纤维化导致组织硬度增加（图1）。从生育期老鼠的卵巢中去除胶原蛋白后，卵巢的生物力学特性恢复到与年轻对照鼠相似的水平，并延长了生育寿命的相关参数。此外，透明质酸（HA）是一种促进组织水合作用和柔韧性的糖胺聚糖，随着年龄增长，卵巢中的HA减少。HA的年龄相关下降可能会导致卵巢硬度增加，因为缺乏Has3（一种主要的卵巢基质透明质酸合成酶，随着年龄增长其表达减少）的老鼠卵巢比同龄对照老鼠卵巢更为僵硬。卵巢基质的年龄相关硬化可能会影响卵泡发生和质量。除了胶原蛋白和透明质酸外，对来自生育期年轻和年老小鼠的原生和ECM富集卵巢的蛋白质组学分析还表明，随着年龄的增长，核心基质蛋白和与基质相关的蛋白质出现了更广泛的失调，其中一些在其他器官的纤维化中发挥了作用。
纤维化通常在炎症之后发生，而卵巢基质随着年龄的增长变得炎症性。随着年龄的增加，卵巢会表达更高水平的促炎和促纤维化细胞因子，如白介素-6，以及参与免疫细胞招募的基因。此外，单细胞RNA测序揭示了与年龄相关的免疫细胞群体的变化，几种参与适应性免疫的淋巴细胞数量增加。来自老鼠的卵巢还包含一种独特的多核巨噬细胞群体，这些巨噬细胞与慢性炎症和非血红素铁积累相关。游离铁是一种过渡金属，通过费顿反应和哈伯-魏斯反应在红氧还原过程中催化羟基自由基的形成，从而促进活性氧（ROS）的生成。将外源性铁过载给予年轻小鼠会导致巨噬细胞增大，这表明与年龄相关的铁积累可能会引起巨噬细胞的形态学变化。非血红素亚铁的积累也表明红氧还原活性铁水平的增加，这可以促进氧化应激。
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）是一个至关重要的代谢辅酶和底物，参与多个生理功能，包括细胞redox、线粒体稳态、免疫细胞功能以及基因组和表观遗传稳定性，且NAD代谢随着年龄的增长发生变化。卵巢中的NAD+水平在中年开始下降，早于其他组织，这是由于NAD水解酶CD38的消耗增加。随着年龄的增长，卵母细胞中的NAD+也会减少。基因删除CD38或补充NAD+能够改善与年龄相关的卵巢功能障碍，维持卵巢储备，减少卵巢炎症，改变免疫特征，并通过提高卵母细胞的线粒体功能来改善卵母细胞的结果。
细胞衰老是衰老组织的一个标志，指的是细胞周期停滞的状态，通常是对多种刺激的反应。衰老细胞在增殖停滞后仍然存在，并产生与衰老相关的分泌表型（SASP），这些表型可能具有致病效应。尽管目前没有统一的标志物来定义衰老细胞，但一些标志物在衰老细胞中常常被观察到。与衰老相关的β-半乳糖苷酶和周期蛋白依赖激酶抑制因子2A（CDKN2A）阳性细胞已在老鼠的卵巢基质中被发现，无论其生育状态如何。然而，与老年雌鼠相比，退休繁殖雌鼠的卵巢中CDKN2A阳性细胞更为丰富。此外，与年轻雌鼠相比，老鼠的卵巢中具有较高比例的Cd74阳性和Cxcl10阳性SASP成纤维细胞。进一步的研究有必要确定卵巢中衰老细胞的身份，并描述其特定的衰老表型。
卵母细胞和卵子的动态变化
出生时，原始卵泡内的卵母细胞在减数分裂 I 的前期停滞，其特征是完整的生发囊泡 （ germinal vesicle, GV） 或细胞核。在卵泡发生过程中，卵母细胞大小增加，但在前期 I 中仍然停滞。在卵泡发生结束时，为了响应 LH 激增，卵母细胞经历核成熟，为受精做准备。卵母细胞的核成熟涉及减数分裂 I 的恢复和减数分裂进展以形成整倍体配子。减数分裂 I 的完成导致同源染色体通过不对称细胞分裂分离。这种不对称的胞质分裂使配子能够保留其大部分细胞质和细胞大分子，同时将多余的染色体组挤出到极体中。卵母细胞立即进入减数分裂 II 中期 （MII），中间没有一轮 DNA 复制。能够受精的成熟配子，现在称为卵子，在 MII 保持停滞，直到受精开始完成减数分裂 II。卵母细胞的细胞质成熟发生在卵泡形成和卵母细胞成熟的最后阶段，以允许 mRNA、蛋白质和其他大分子的积累，这将支持减数分裂、受精和合子基因组激活之前的早期胚胎发育（补充图 4c）。
核成熟
卵母细胞的核成熟在年龄增长时会受到干扰，这一过程涉及减数分裂 I 的恢复和减数分裂的进行，以形成正常染色体数的配子（补充图 4c）。在前期阶段，染色体会经历同源重组，同源染色体通过交叉联接形成联会，从而防止不分离现象的发生。随着生育年龄的增加，交叉联接的频率降低，且带有单体染色体（univalents）的卵母细胞频率增加92-94（图 1）。
卵母细胞是否能够经历减数分裂成熟，似乎取决于卵原核（GV）的定位；具有外围GV的卵母细胞极有可能不会进行极体排出（PBE）。衰老与GV居中的效率降低相关，从而导致PBE率的下降。卵母细胞有两种正常的染色质配置：非包围核仁的去凝缩型真染色质，与转录活性相关；或包围核仁的凝缩型异染色质，与转录静止相关。来自生育年龄较大的小鼠的卵母细胞通常具有较小的GV，且染色质配置高度凝缩，通常在核仁内分布不规则，或呈团块状。
关于减数分裂进程的效率和动力学是否随年龄变化，尚存在争议。一些研究报告称，随着年龄的增长，更多比例的卵母细胞能够进入第二次减数分裂（MII），而另一些研究则报告了相反的结果。此外，一些研究表明减数分裂I的动力学随年龄增加而加快，而另一些研究则记录了减缓的进程或没有变化。这些差异可能与品系有关。
染色体倍性状态以及纺锤体和染色体的改变
非整倍体是导致不孕的主要遗传原因，可能导致自然流产或染色体疾病，包括人类的唐氏综合征。在卵细胞中，非整倍体主要是由于同源染色体在减数分裂 I 期间的不分离以及在减数分裂 II 期间姐妹染色单体的过早分离。年龄的增长与减数分裂 I 中的缺陷相关，包括染色体在中期 I 纺锤体上的错位、在后期 I 中滞后染色体的频率增加，以及随之而来的分离错误的增加。与年龄相关的 MI 错误分离可能是由于动粒-微管（K-MT）连接的改变，因为随着年龄的增长，卵母细胞中较少的动粒对在纺锤体极点上进行端对端连接。动粒-微管连接不当可能是由于纺锤体微管动力学的改变，导致暂时性多极纺锤体的形成，并且在修正K-MT 连接错误的过程中失去相关蛋白。此外，来自老鼠的卵母细胞具有受损的动粒组装和较薄的微管束，更容易形成异常连接。
纺锤体组装检查点（SAC）在老年小鼠的卵母细胞中仍然有效，它可以防止在所有动粒-微管（K-MT）连接稳定之前进入后期分裂，这表明其他机制可能导致与年龄相关的错位分离。Sirtuin 2（SIRT2），一种NAD+依赖性组蛋白去乙酰化酶家族成员，在调节SAC功能中起着重要作用，通过形态寡聚物去除SIRT2会破坏纺锤体组织、染色体排列和K-MT连接。值得注意的是，老年小鼠的卵母细胞中SIRT2蛋白表达减少，这可能促使非整倍体的发生。然而，进一步的研究需要澄清SIRT2的独特功能以及其他Sirtuin家族成员的潜在补偿作用，因为来自全身Sirt2基因敲除小鼠的卵母细胞表现出正常的纺锤体形态。高分辨率显微镜观察揭示了与年龄相关的染色体形态、形状和空间排列的差异。来自生殖老化小鼠的卵母细胞显示染色体之间的粘附性增加，表明同源和非同源染色体之间有更多的相互作用，这增加了异常分离的可能性。老年小鼠的减数分裂染色体也比年轻小鼠的更为僵硬。
PSSC最终导致非整倍体，主要是由于与年龄相关的染色体凝聚力下降（见图2）。染色体臂上的凝聚力保持同源染色体在第一次减数分裂后期之前的连结，而着丝粒凝聚力则将姐妹染色单体连接在一起，直到第二次减数分裂后期。凝聚蛋白介导染色体的凝聚，在胚胎发育中的减数前S期，凝聚蛋白被加载到卵母细胞中的染色体上。凝聚蛋白的时序性去除对忠实的染色体分离至关重要。在卵母细胞中，染色体相关的凝聚蛋白在没有周转的情况下保持，直到排卵时在减数分裂成熟过程中被调控性去除。凝聚复合物的一个核心组成部分是kleisin亚基REC8。去除REC8会导致同源染色体解离和姐妹染色单体分离，而在卵母细胞生长期通过异位表达Rec8无法恢复这一过程。凝聚蛋白加载到染色体上的时间与减数分裂之间的延长，导致凝聚蛋白的耗竭，这表现为随着年龄增加，卵母细胞中动粒间距离的增大。与年龄相关的凝聚力丧失还会触发着丝粒染色质的去压缩，导致动粒断裂和在第一次减数分裂（MI）及第二次减数分裂（MII）中出现不正确的K-MT连接，这进一步促进了非整倍体的发生。此外，随着卵母细胞年龄的增加，细胞内pH升高，这可能改变凝聚蛋白环的结构。
与PSSC增加一致，来自老鼠的配子在第二次减数分裂后期表现出增加的滞后染色体发生率，这与有丝分裂检查点（SAC）功能障碍相结合，可能有助于非整倍体的发生。凝聚复合物在第一次减数分裂开始时通过分离酶沿染色体臂被切割，然而，来自老鼠的卵母细胞对分离酶的过早激活更为敏感，这可能导致染色体分离错误。然而，着丝粒凝聚力受到shugoshin 2（SGO2）的保护，SGO2通过防止凝聚蛋白亚基REC8的磷酸化，使其对分离酶切割具有抗性。SGO2还通过与SAC和染色体乘客复合物的相互作用，在第一次减数分裂过程中发挥K-MT连接错误修正的作用。随着年龄的增加，SGO2的表达减少，导致着丝粒凝聚力减弱，这可能有助于PSSC的发生。
DNA损伤
卵母细胞中的基因组不稳定性可能导致染色体异常，从而导致不孕或发育障碍。因此，一些研究报告称，来自老鼠的去卵泡卵母细胞（denuded oocytes）和卵泡复合体（COCs）中凋亡增加。来自老鼠的MII卵子的DNA碎片化程度较高，这可能是凋亡的早期指示（图1和图2）。有趣的是，尽管去卵泡卵母细胞中的凋亡发生率（其中去除了周围的卵泡颗粒细胞）随着年龄的变化没有差异，但来自老鼠的COCs表现出更高的凋亡率。这表明，卵母细胞与周围卵泡细胞之间的年龄相关沟通变化可能驱动凋亡。卵母细胞中DNA损伤的年龄相关增加也可能是由于DNA修复基因表达减少以及卵泡液中抗氧化物（包括褪黑激素）减少所致。此外，除非K-MT连接无误，SAC会在减数分裂I期防止过渡到后期，在DNA损伤的情况下，SAC还会诱导卵母细胞发生减数分裂I期停滞。因此，来自老鼠的卵母细胞中SAC功能的破坏使得减数分裂得以继续进行，尽管存在DNA损伤。关于衰老如何影响卵母细胞中的DNA损伤和修复的问题仍然存在争议，一些研究小组报告称，卵母细胞修复紫外线引起的损伤的能力在整个生殖衰老过程中维持在较高水平，而另一些研究则指出，卵母细胞和MII卵子中的DNA双链断裂随年龄增加而增加。
端粒缩短
在卵母细胞中，端粒长度可能预测发育能力。卵母细胞中的端粒长度随着年龄的增长逐渐减少，且在年轻和中年小鼠中比老年小鼠更具异质性。端粒末端没有保护帽时的DNA损伤，被称为端粒功能障碍诱导的焦点，随着卵母细胞年龄的增长而增加，这表明基因组完整性的丧失。端粒酶的表达和相对活性也随着年龄的增长而在卵母细胞中减少。作为端粒潜在调节因子的去乙酰化酶6（SIRT6）在卵母细胞中的表达随着年龄的增长而减少。年轻小鼠卵母细胞中SIRT6的敲除导致端粒缩短，并在随后的二细胞胚胎中增加端粒功能障碍诱导的焦点，而在老年小鼠卵母细胞中过表达SIRT6则能拯救这些胚胎表型。
表观遗传调控
随着生育年龄的增加，基因组范围的DNA甲基化水平下降，并且与DNA甲基转移酶的表达减少相关。在老年小鼠的二次极体卵母细胞中，DNA甲基转移酶的丰度减少，且其在细胞质与核之间的转运也下降。尽管一些研究发现印记基因无论年龄如何均保持适当的甲基化，但也有研究报告称，卵母细胞中母源印记基因的表达随年龄增加而升高，表明甲基化的丧失。有趣的是，来自老年小鼠的卵母细胞中，组蛋白3在赖氨酸4（H3K4me3）和赖氨酸36（H3K36me3）的三甲基化水平减少。H3K4me3在减数分裂成熟过程中调控mRNA降解，并且与H3K4me3的减少一致，老年小鼠的卵母细胞中mRNA降解受到损害。进一步地，CxxC-finger蛋白1（CXXC1）对于H3K4me3的积累至关重要，来自卵母细胞特异性Cxxc1敲除小鼠的配子在mRNA降解上表现出类似老年小鼠卵母细胞的缺陷。此外，卵母细胞中的核糖体DNA甲基化随年龄增加。由于DNA甲基化对于染色质重塑、基因组印记、X染色体失活及许多其他细胞活动至关重要，老年小鼠卵母细胞中的异常DNA甲基化可能导致卵子质量下降。
一些研究探讨了衰老小鼠模型中配子中组蛋白4在赖氨酸5、8、12和16位点的乙酰化情况。H4K5和H4K8的乙酰化模式在不同年龄的卵母细胞中相似，但来自老年小鼠的卵母细胞中H4K12和H4K16的乙酰化水平较低。H4K12在年轻小鼠的卵母细胞中完全去乙酰化，但在老年小鼠的二次极体卵母细胞中，不论是在体内还是体外成熟的卵母细胞中，H4K12却仍保持乙酰化状态，这表明衰老可能打乱了调控减数分裂过程中组蛋白去乙酰化的机制。总体来看，有研究认为，异常的组蛋白去乙酰化可能导致与年龄相关的染色体非整倍体和不育。
细胞质成熟
女性配子在卵泡生成和卵母细胞成熟的最后阶段积累mRNA、蛋白质和大分子，这些物质支持减数分裂成熟、受精和早期胚胎发育（补充图4c）。衰老与细胞质成熟的改变相关（图1）。由于成熟的卵母细胞在转录上处于沉默状态，因此蛋白质翻译的严格调控对减数分裂成熟至关重要，而随着年龄的增长，翻译效率会下降。老年小鼠的卵母细胞表现出降解酶活性减少，并且与蛋白质稳态和蛋白质代谢相关的基因表达减少，导致受损蛋白质的积累。例如，氧化损伤会减少α-微管蛋白的稳定性和聚合能力，从而破坏减数分裂纺锤体的完整性。然而，最近的研究发现，来自老年小鼠的卵母细胞并未表现出降解酶活性下降或蛋白质聚集增加。相反，这些卵母细胞以及特定的卵巢间质细胞，包含高稳定性的长寿命蛋白，这些蛋白对于维持蛋白质稳态至关重要，并参与关键的细胞结构，如线粒体、核糖体和细胞骨架的组装。这些蛋白质的极高稳定性被认为是保护长寿命细胞（如女性生殖系细胞）免受损伤积累的适应性特征。因此，这些稳定蛋白质的最终丧失可能会导致卵母细胞和卵巢功能随年龄下降。此外，来自老年小鼠的卵母细胞通常只有一个核仁，而来自年轻小鼠的卵母细胞则有多个核仁。随着年龄增长，核仁的结构和功能会发生变化，而核仁对于核糖体和蛋白质的生产至关重要。例如，来自老年小鼠的卵母细胞中，纤维蛋白酸酯酶（fibrillarin）的表达增高，这与核糖体RNA的异常甲基化以及翻译精度差的核糖体生产有关。与年轻小鼠相比，来自老年小鼠的卵母细胞中，溶酶体（促进蛋白质降解）和自噬体（将物质输送到溶酶体）数量减少，表明宏自噬功能障碍。由于这一途径对于清除受损蛋白质至关重要，因此其功能障碍可能会导致卵母细胞质量下降。来自老年小鼠的卵母细胞表现出与年龄相关的转录组变化。全基因组分析显示，诸如Cdk10、Cep63和Chek2等减数分裂调控因子在老年小鼠卵母细胞成熟过程中与年轻小鼠相比呈差异性表达。有趣的是，Brca1、Brca2、Sirt1、Sgo2a和Sgk1等转录本在年轻和老年小鼠卵母细胞中的表达水平相似，但它们的翻译随着年龄的增长显著下降。关键转录本翻译的下调可能会导致老年小鼠卵母细胞中更高的成熟失败和非整倍性发生率。母源mRNA的降解和清除对于减数分裂恢复和合子基因组激活是必需的，而来自老年小鼠的MII卵子中这一过程受到损害，这可能会导致胚胎发育异常。
除了上述导致蛋白质稳态丧失和宏自噬功能障碍的机制外，卵母细胞在细胞质成熟过程中还会经历金属稳态受损（图2）。在卵子发生过程中，卵母细胞会积累锌，这是减数分裂进程所必需的，因为在锌螯合剂存在的情况下进行的体外成熟会导致卵母细胞停滞在类似减数分裂I末期的状态。此外，在受孕前饲喂锌缺乏饮食的小鼠表现出减数分裂成熟和受精能力的下降，着床和胎盘发育的缺陷，以及增加的妊娠丧失和胚胎发育缺陷。有趣的是，生殖衰老与卵细胞内锌的丰度减少和分布不规则相关，这可能会损害减数分裂进程和生殖结果。
线粒体与氧化应激
如同卵巢体细胞中所见，生殖年龄与卵母细胞线粒体的结构和功能缺陷相关。在年轻小鼠中，卵母细胞的线粒体呈圆形且未分化，关于与老年小鼠卵母细胞相比线粒体嵴数目的报道存在冲突。一些研究表明，由于线粒体嵴为氧化还原反应和ATP生产提供了表面积，较少的嵴和较少的线粒体可能会导致卵母细胞在衰老过程中ATP生产减少。线粒体膜电位是线粒体活动的一个关键指标，并且在老年小鼠的卵母细胞中降低。此外，老年小鼠的卵母细胞中线粒体常常出现空泡化，这可能是细胞凋亡的标志。线粒体质量由线粒体未折叠蛋白反应和线粒体自噬调控。参与这些途径的蛋白质，如HSPD1、LONP1和总PRKN，在卵母细胞中随着年龄的增长而表达减少。
卵母细胞中线粒体的分布也随着年龄变化。在年轻小鼠中，卵母细胞的线粒体在核膜breakdown 过程中集中在核周围，并在减数分裂I期（MI）和减数分裂II期（MII）时围绕染色体。相比之下，老年小鼠的卵母细胞中，线粒体主要聚集在卵质中。与老年小鼠卵母细胞相比，年轻小鼠的卵母细胞中线粒体与肌动蛋白细胞骨架的共定位更为明显，表明这两者之间的关联随着年龄的增长而丧失。事实上，当使用细胞骨架组装抑制剂处理时，年轻小鼠的卵母细胞表现出成熟度下降、ATP生产减少，并且线粒体分布与老年小鼠的卵母细胞相似。与年龄相关的甲基乙二醛积累（这是糖酵解的反应性副产物）可能会导致线粒体定位的改变，因为当年轻小鼠的卵母细胞暴露于外源性甲基乙二醛时，线粒体无法正确定位到纺锤体上，导致减数分裂延迟或停滞。
卵母细胞中的与年龄相关的氧化应激增加了线粒体受损的易感性（图2）。一些研究报告表明，来自老年小鼠的卵母细胞相较于年轻小鼠，具有较低的线粒体DNA（mtDNA）含量和较高的mtDNA突变率。此外，年轻小鼠的卵母细胞在成熟过程中，mtDNA含量会增加，而老年小鼠的卵母细胞则保持稳定。线粒体RNA的质量和变异不会随年龄变化。
与年龄相关的氧化应激还会改变卵母细胞的脂质组，特别是减少几类磷脂的丰度，可能会影响卵母细胞的质膜。脂质在高氧化应激环境中的过氧化作用会产生自由基，如羟基壬烯醛（4-HNE），并且4-HNE会在老年卵母细胞中积累。将来自年轻小鼠的卵母细胞处理4-HNE会降低卵母细胞的胚胎发育能力（PBE）、干扰纺锤体并诱导染色体非整倍体。此外，活性氧（ROS）的增加及其与一氧化氮不足的关系与卵母细胞质量下降有关。
受精与胚胎发育
受精、卵子活化和胚胎发育 卵子激活包括精子融合后（或孤雌激活后）启动的一系列事件，这些事件促进了多精阻滞、卵子中减数分裂的恢复以及向胚胎发育的有丝分裂过渡（补充图4d）。在受精时，精子可溶性因子 PLCζ 将磷脂酰肌醇 4,5-二磷酸 （PIP2） 水解为甘油二酯 （DAG） 和肌醇 1,4,5-三磷酸 （IP3）。IP3 与卵内质网上的受体结合，从而触发一系列胞质钙 （Ca2+） 振荡。Ca2+ 参与启动减数分裂恢复和皮质颗粒胞吐作用 （CGE）。卵在 MII 被停滞，MII 由 M 期促进因子 （MPF） 活性维持。Ca2+ 启动一系列磷酸化事件，导致 MPF 失活，从而触发减数分裂恢复。MPF 活性降低会降低丝裂原活化蛋白激酶 （MAPK） 的活性，这是完成减数分裂、挤出第二极体和诱导原核形成所必需的。Ca2+ 释放还参与 CGE 的激活，以促进透明带硬化并确保多精阻断。在卵泡生成过程中，皮质颗粒 （CGs） 在卵母细胞中形成并迁移到皮层。响应细胞内 Ca2+ 的增加，CGs 与细胞膜融合并释放其内容物以修饰透明带的细胞外基质。雌性和雄性原核的融合导致染色体重排，产生二倍体受精卵 （E0.5）。1-细胞胚胎经历有丝分裂，将细胞质分成全能卵裂球（小鼠的 E0.5-3.0），并从母体基因组激活过渡到合子基因组激活。在 8-细胞阶段，胚胎经过压实以产生桑椹胚，并发生第一次细胞谱系命运决定。第一个细胞命运决定结果是形成囊胚（小鼠中的 E3.5），它包含产生胚胎组织的多能细胞的内部细胞团 （ICM） 和 产生胚胎外组织的滋养外胚层 （TE）。
受精与卵子激活
女性生殖衰老的特点是卵子数量和质量的下降，这可能会影响受精、卵子激活和胚胎发育。随着年龄的增长，受精率下降，部分原因是衰老小鼠每个周期排卵的卵子数量减少。尽管在某些小鼠品系中，卵巢过度刺激可产生相同总数量的排卵卵子，无论年龄如何，但衰老小鼠中卵母细胞破碎、未受精卵和低质量胚胎的发生率更高。体外受精的成功率对于年轻和老年小鼠的卵子相似，但将年轻小鼠的卵子暴露于老年小鼠的血清中，会抑制体外受精的结果，这表明与年龄相关的微环境变化可能是衰老小鼠受精率下降的一个因素。
卵子激活包括一系列分子变化——由孤雌生殖或受精引发——这些变化对于介导卵子到胚胎的转变是必要的（补充图4d）。钙离子（Ca2+）的波动对于解除卵子在第二次减数分裂停滞状态并启动胚胎发生至关重要。在受精时，精子特异性的磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C（PLCζ）水解磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（PIP2）为二酰甘油（DAG）和肌醇1,4,5-三磷酸（IP3）。IP3与内质网上的受体结合，启动钙离子波动。钙离子在配子中的动态变化具有小鼠品系特异性，但有证据表明，随着年龄的增长，卵子中钙离子储存的大小和参与钙稳态调节的基因表达会减少。高级生殖年龄还与精子引发激活后补充钙离子储存的能力下降，以及孤雌生殖激活后钙波动的频率和持续时间减少相关。总体而言，来自老年小鼠的卵子在孤雌生殖激活和发育上比来自年轻小鼠的卵子更具抗性。
与年龄相关的钙信号变化已被与特定的信号通路联系起来，包括蛋白激酶C（PKC）家族（图2）。来自老年小鼠的卵母细胞表现出PKC同种型的表达减少和PKC活性降低；而在老年小鼠卵母细胞中用PKC激动剂处理也无法挽救这一表型。高水平的成熟促进因子（MPF）和有丝分裂激活蛋白激酶（MAPK）维持MII期停滞，而卵子激活过程中的钙波动会导致MPF和MAPK活性的降低。来自生殖年龄较大的小鼠的卵子在激活后含有更高的MPF和MAPK活性，这与减数分裂恢复延迟、卵裂未能完成（PBE失败）以及前核形成延迟相关。
胚胎发育
随着年龄的增长，胚胎发育受到损害（图1和图2）。在老年小鼠体内发育的胚胎表现出细胞碎片化增加、细胞数量减少、胚外胚层标志物Cdx2表达降低以及较小的囊胚腔，这可能与较高的细胞死亡率有关。此外，来自老年小鼠的合子和二细胞胚胎表达较少的DNA损伤修复相关蛋白，这也促进了非整倍体的发生。在体外发育的胚胎在囊胚形成和与细胞分裂相关基因的表达方面也表现出类似的损伤。
老年小鼠胚胎发育不良可能与染色质的乙酰化增加有关；在年轻小鼠的胚胎样体中诱导的染色质乙酰化导致了与老年小鼠类似的囊胚发育。此外，来自老年小鼠的胚胎表达较高水平的促炎性趋化因子CXCL5，这是一种衰老相关分泌表型（SASP）的特征。用CXCL5处理年轻小鼠的胚胎抑制了滋养层细胞的扩展，减少了着床并损害了胚胎发育，表型模仿了老年小鼠的情况。
来自老年小鼠的胚胎也表现出线粒体功能障碍。年轻和老年雌性小鼠受精卵的单细胞RNA测序分析表明，涉及离子运输的基因发生了改变。老年小鼠胚胎的细胞内pH值增加，这部分是由于HCO3−/Cl−交换活性降低所致。改变的pH值通过降低膜电位和增加活性氧（ROS）来影响胚胎中的线粒体功能。线粒体DNA（mtDNA）是胚胎发育的决定因素，在合子基因组激活之前，必须支持早期胚胎分裂细胞中的线粒体生物生成的稳定水平。与年轻小鼠的胚胎相比，老年小鼠胚胎中的mtDNA含量波动，且基因表达不足以支持线粒体生物生成，导致能量不平衡，从而导致受精前胚胎发育失败。此外，老年小鼠囊胚中mtDNA水平的不稳定与染色体数目异常（单倍体）相关。有趣的是，老年小鼠卵母细胞中SIRT1蛋白表达的减少也可能促成胚胎发育受损，因为卵母细胞特异性Sirt1敲除小鼠由于氧化应激增加和早期胚胎分裂紊乱而表现出早期不育。最后，老年小鼠胚胎在正常分化事件之前，CDX2和NANOG等细胞命运决定标志物的表达加速，从而导致胚胎发育失败。
繁殖与怀孕
着床和怀孕期间的子宫动力学 排卵后4天囊胚到达子宫。ICM细胞进一步分化为外胚层和原始内胚层，分别产生胚外内胚层组织和胎儿组织和胚外中胚层。随着胚胎继续有丝分裂，它从透明带孵化。植入是感受性囊胚和受体子宫内膜之间同步的结果，导致胚胎附着、侵袭和胎盘发育（补充图 4e）。容受性窗口（ window of receptivity ）定义了受孕酮和雌激素调节的接受性子宫与有能力的囊胚之间的时空串扰期。子宫内膜上皮细胞和基质细胞在周期的增殖部分响应雌激素水平的升高而增殖，而黄体酮负责周期黄体期基质细胞的分化和蜕膜化。在小鼠中，胚胎植入子宫内膜隐窝。胚胎与管腔上皮接触后，子宫内膜基质细胞发生蜕膜化。蜕膜细胞是分泌性的和瞬时的，除了支持母体血管灌注外，还可以侵入囊胚。滋养层由源自滋养外胚层的胎儿细胞组成，侵入并迁移到母体蜕膜中，并分化成各种胎盘前体。因此，胎盘是源自胎儿和母体细胞的内分泌器官，介导胎儿和母亲之间的交流。胎盘具有支持怀孕和胎儿生长所需的许多功能，包括保护胎儿免受母体免疫系统的影响、营养和氧气供应以及废物清除。适当的胎盘发育和功能对于妊娠进展是必要的，而其改变会导致妊娠并发症和流产。
繁殖
随着年龄的增长，老龄小鼠的繁殖能力受损，表现为交配行为、妊娠和后代结果的紊乱（图1）。繁殖年龄较大的雌性小鼠在与雄性配对后，受孕时间延长，阴道栓存在率降低。生育次数与年龄相互作用，影响交配行为，未曾繁殖的老年雌性小鼠需要更长的交配时间才能成功怀孕，与曾经繁殖过的老年小鼠相比。随着年龄增长，体重增加影响繁殖结果。那些维持较低体重的衰老小鼠表现出更高的生育力和更长的寿命。随着年龄的增长，窝重显著减少。窝重开始在中年时下降，在多个品系中，12个月龄后完全停止活仔出生。尽管绝对的繁殖寿命因品系不同而有所差异，但观察到的与年龄相关的窝重减少是高度穿透性的，并且与卵巢储备的耗竭一致。然而，即使年轻小鼠和老年小鼠排卵的卵子数量相似，老年小鼠的窝重较小，这表明衰老还会损害子宫功能和胎儿发育。
子宫形态与动力学
子宫是一个内分泌响应器官，在发情周期中经历动态的形态变化，以支持胚胎着床和妊娠。子宫由子宫内膜和子宫肌层组成，子宫内膜包括上皮和基质部分，这些部分在发情/月经周期和妊娠过程中会对激素产生反应；子宫肌层则是一个平滑肌层，在妊娠期间会扩展，在分娩时则会收缩（补充图4e）。随着年龄的增长，子宫的大小和重量会增加，尽管细胞增殖随着年龄的增长而减少，但由于结缔纤维的产生增多以及弹性纤维合成的失败，子宫内膜的纤维网络会增多（图1）。随着年龄的增长，子宫基质细胞也表现出DNA碎片化的增加，进而导致细胞凋亡的增加。调控营养运输、细胞分化和基因印记的基因表达发生变化，子宫中促炎细胞因子和趋化因子的表达也随年龄增加而升高。
在生育能力衰退的老年小鼠中，子宫表现出形态学异常，包括自发性子宫病变的发生率较高，如腺性囊性增生和子宫肌层肿瘤。子宫内膜出现萎缩，表现为薄且角化的上皮，内膜腺体扩张以及嗜酸性胶状物质的存在。子宫肌层显示出不典型的平滑肌形态，并伴有更多的平滑肌瘤、平滑肌肉瘤和血管化肿瘤的发生。老化的子宫基质细胞表现出DNA碎片化的增加，进而导致细胞凋亡的增加，部分原因是终止蛋白30（Tp-30）水平的升高。氧化还原失衡促进了子宫中的氧化应激，表现为促氧化酶NOX1的表达增加以及子宫内膜基质中蛋白质羰基的积累。
衰老子宫的一个主要表现是激素受体敏感性和反应性的丧失。随着年龄的增长，子宫内雌激素和孕激素受体的水平、结合能力和激活作用发生减少，并且在激素不规律之前，中年期雌激素应答基因网络发生改变，导致激素功能紊乱。这些激素受体动态的变化可能会影响子宫内膜的生长和对胚胎植入的敏感性。
胚胎植入和妊娠
与年轻小鼠相比，老年小鼠的胚胎植入减少，胚胎吸收增加。植入失败的原因有多种，包括缺乏黄体激素支持、影响胚胎植入基因转录的表观遗传改变，以及蜕膜化缺陷（见图2）。在蜕膜化过程中，子宫内膜细胞增殖并分化，以支持滋养层细胞侵入植入胚胎。来自老年小鼠的胎盘含有过多的滋养层巨细胞，这与子宫内生长受限和胎盘迷宫（即营养和气体交换的部位）发育失败有关。此外，衰老的子宫间质环境可能干扰正常的滋养层功能。来自老年子宫间质的条件培养基诱导分化为海绵滋养层细胞和滋养层巨细胞，并降低由Eomes、Cdx2和Esrrb编码的滋养层自我更新标志物的表达，从而减少胎儿对胎盘的贡献。滋养层缺陷似乎是衰老胎盘的固有特征，因为当来自老年小鼠的胚胎移植到年轻的养母小鼠子宫中时，妊娠并发症可以得到拯救，表现为正常的植入、滋养层分化以及胎儿发育，胎儿的顶臀长度相似。
另一个与植入缺陷相关的机制是胎盘和胎儿组织中CpG岛（CGIs）DNA甲基化保真性的丧失，导致CGI的高甲基化。CGI高甲基化破坏了必要的植入基因的转录调控，改变了母体和父源印记基因，从而导致胎儿生长受限或胎盘过度生长，并干扰启动蜕膜化所必需的激素反应途径。植入后基质和血管重塑在衰老过程中受到损害；老年小鼠未表现出子宫动脉壁质量增加、平滑肌层分化或细胞增殖的现象。最后，氧化应激也会影响植入。老年小鼠的胎盘中铜/锌依赖性超氧化物歧化酶（SOD）活性增加，提示启动了一种补偿性的活性氧（ROS）清除机制。
老年小鼠的分娩并发症，包括妊娠期延长和分娩持续时间增加（见图1）。妊娠时间延长部分是由于晚期妊娠中孕酮水平下降的反应迟钝所致。与年轻小鼠相比，老年小鼠的分娩时间更长，表现为频繁但短暂的宫缩。与年龄相关的连结蛋白-43和催产素受体表达减少，损害了子宫肌层的细胞间通信，从而影响了宫缩频率。此外，子宫平滑肌中的线粒体DNA拷贝数较低，可能会促进与年龄相关的分娩改变，因为线粒体调节平滑肌的收缩。老年小鼠还表现出生殖道的改变，包括宫颈扩张和僵硬增加，以及宫颈区域阴道的神经支配减少。总体而言，妊娠期的子宫和胎盘展示了多种与年龄相关的机制，导致不利于胎儿生长和分娩的环境。
后代结局
高母龄对后代健康产生负面影响。老年小鼠的妊娠期和出生后的胎儿死亡率较高。死产、先天性畸形和出生缺陷在老年小鼠的后代中更为普遍，包括胎儿生长受限、心脏缺陷、水肿以及大脑和神经管畸形。老年小鼠的后代往往出生体重较低。此外，由于与年龄相关的母性行为和护理变化，它们更容易被母鼠食用。因此，这可能导致后代丧失，并影响数据的解释，除非进行严格的断奶前监测。
对老年母鼠后代胚胎组织的Global转录组分析揭示了胎儿大脑的转录组异质性，伴随着与胎儿神经发育、晶状体诱导和观察学习相关基因的下调。此外，与H3K4甲基化相关的基因减少显示了高母龄对胎儿大脑的年龄依赖性表观遗传效应。证据表明，老年小鼠的幼崽具有较低的学习能力和整体较低的预期寿命。随着全球越来越多女性推迟生育，关于后代结局和专注于高母龄跨代效应的综合分析已成为活跃的研究领域。
结论与展望
生理性衰老小鼠模型揭示了年龄对生殖细胞、组织和器官的全面影响，进而损害了生育能力和生殖健康结局。女性生殖衰老与下丘脑-垂体-卵巢（HPO）轴的失调以及卵巢储备的耗竭相关，导致每个周期排卵的卵子数量减少。卵巢基质变得纤维化和炎症化，部分原因是氧化应激增加，这也促使组织刚度增加。在卵母细胞及其卵泡支持细胞中，线粒体功能受损、表观遗传调控改变、DNA损伤增加，端粒变短。衰老与卵母细胞中染色体不相等（非整倍体）增加相关，原因包括纺锤体缺陷和染色体凝聚力丧失。此外，卵母细胞的蛋白稳态随着年龄的增长而受到干扰。这些缺陷导致卵子激活能力下降以及胚胎发育受损，这与年龄相关。母亲年龄较大也与子宫形态改变和对类固醇激素的反应迟钝有关，从而导致胎盘植入受损、胎儿数量较少和更多的不良胎儿结局。
理解衰老如何影响整个生殖轴是非常重要的，因为衰老在一个器官中扰动的过程会影响其他器官的过程。例如，在小鼠中，衰老相关的一个特征性表现是胎儿数量减少。最初，人们认为这是由于卵巢储备耗竭和每个周期排卵卵子的数量减少所致，但这一表型显然是多因素的。随着年龄增长，子宫形态和功能的异常、繁殖行为的改变、早期胚胎发育受损以及着床缺陷可能都参与其中。通常，衰老对这些器官和过程的影响是单独研究的；而通过移植和共培养模型，可以研究多层次的相互作用。例如，通过研究将年轻小鼠子宫移植到年老小鼠体内的胎儿数量，可以区分衰老在配子和子宫层面上的后果。女性生殖衰老领域仍存在显著的研究空白；特别是衰老对乳腺、输卵管、宫颈、阴道以及卵巢周围脂肪组织的影响尚未得到充分表征。总体而言，我们预计该领域未来的研究将整合衰老相关扰动在生殖轴以及其他受内分泌变化影响系统中的多层次效应。
衰老相关功能衰退的机制在各个器官系统中大体是保守的。在已描述的12个衰老特征中，有11个与小鼠的女性生殖系统衰老相关（图1和图2）。例如，线粒体功能障碍和表观遗传变化与卵巢、卵母细胞、胚胎和子宫的衰老有关。这最终导致卵泡发育和配子质量下降、受精和胚胎发育不良，以及着床和胎儿发育受损。此外，与下丘脑-垂体-卵巢（HPO）轴失调相关的衰老内分泌特征会导致细胞间通讯的变化，进而产生更广泛的系统性效应。由于女性生殖系统的衰老通常早于其他器官系统，因此该领域的研究成果可能有助于揭示全身躯体的衰老过程。除了衰老的保守特征外，我们还将基质和血管重塑以及金属稳态失调纳入了女性生殖衰老的范畴（图1和图2）。卵巢外基质（ECM）衰老引起的失调会导致纤维化和组织僵硬，从而影响卵泡生长、排卵以及卵巢癌等病理的发生发展。随着年龄增长，金属稳态的丧失会影响配子的减数分裂和发育能力。尽管我们的研究没有揭示微生物组失衡作为衰老机制之一，但它可能在其中发挥重要作用。阴道微生物群失调是更年期的特征之一，它影响生育、妊娠和分娩；此外，它还会增加感染的易感性并损害生活质量。
尽管近年来女性生殖衰老领域受到了更多关注，但这一主题的研究自20世纪50年代以来便已开始。许多数十年前的基础性发现已经被重新审视，借助先进的技术、工具和模型来验证新的机制假设。采用无偏的组学方法，或者利用现有的组学数据集以及单细胞和空间转录组学技术，正在快速发展，并揭示了许多关于生殖器官如何随每个生殖周期以及整个生命周期发生变化的细节。
尽管生殖衰老不是一种疾病，但它是一个重要的生物学过程，可以作为治疗干预的目标，不仅有助于改善生殖健康和生育能力，还能缓解内分泌功能障碍并改善更年期后的健康。从这些新阐明的衰老机制中涌现出了一些经验基础的治疗机会（见表2）。例如，卵巢纤维化可以通过靶向线粒体代谢和基质重塑来逆转。通过抗纤维化药物治疗和二甲双胍补充，可以通过减少纤维化胶原沉积、促进清除促纤维化和产生衰老相关分泌表型（SASP）纤维母细胞的免疫群体、恢复排卵能力并降低与年龄相关的炎症基因表达，促进老鼠卵巢的组织稳态（见表2）。其他有前景的治疗方法包括那些靶向与年龄相关的线粒体功能障碍以改善卵母细胞质量的方法，如NAD+补充、BGP-15治疗和线粒体替代（见表2）。尽管大多数治疗策略仍处于临床前阶段，但在小鼠中识别的许多生殖衰老机制在人类中也有保守性（见表3）。因此，预期具有较强的转化潜力。
生殖衰老的影响超越了个体，因为生殖细胞是未来世代的构建基石。受孕和产前发育的环境可能会使后代更易于终生健康状况。理解年龄对生殖系统的影响，将为改善跨代健康结果提供机会。
Balough, J.L., Dipali, S.S., Velez, K. et al. Hallmarks of female reproductive aging in physiologic aging mice. Nat Aging 4, 1711–1730 (2024). https://doi.org/10.1038/s43587-024-00769-y
