流程图：
研究结果：
一、鉴定ARDS 和对照组间的AMRDEG（自噬和代谢相关差异表达基因）
1. 将两组ARDS数据集GSE89953和GSE32707合并，去除批次效应后得到一体化GEO数据集（图2A、C）。图2B、D的主成分分析（PCA）进一步证实消除批次效应的效果良好。
2. 通过AMRG和差异表达基因交叉获得26个AMRDEG（图3A-C）。图3D显示了AMRDEG在人类染色体上的位置。两组间所有AMRDEGs差异显著（P<0.001）（图3E）。
3. 对ARDS中AMRDEG的进一步分析显示，这些基因之间存在多重相关性（图4A）。相关程度由r值表示，HSP90AB1和HSPA8之间的协同效应最强，其次是STK11和PINK1，最后是SIRT1和MYC（图4B-D）。 相比之下，CTSB和BIRC5之间的竞争效应最强，其次是CFLAR和BIRC5，最后是STK11和BIRC5（图4E-G）。
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ROC曲线分析显示，26个AMRDEG中有17个具有较高的预测准确率，ROC曲线高于0.9(图4H-N)。
二、通过3种机器学习算法LASSO、SVM和RF优化关键AMRDEG的筛选
1. 图5A，B： LASSO回归共筛选了4个基因。
2. 图5C：当变量数为7时，SVM方法的精度达到峰值。
3. 图5D，E：采用RF选择出的在变量重要性排名前10位的基因。
4. 通过重叠三种算法， CTSB和EEF2被鉴定为关键的AMRDEG（图5F）。
三、关键 AMRDEG 预测 ARDS 的诊断效果和预测能力
1. CTSB 和 EEF2的表达在组合数据库中相似（图6A）。作者构建了ARDS发展的预测工具——列线图，包含了这两个与自噬和代谢相关的特征基因。列线图中每个显著变量的值对应一个评分点，将所有特征变量的分数相加得到总分，用来代表ARDS发病风险（图6B）。
2. 校准曲线证实了列线图的准确性（图6C）。DCA显示列线图的应用为ARDS患者带来了益处（图6D）。综上可得，与自噬和代谢相关的特征基因在预测ARDS进展方面具有较好的诊断效果。
3. 为了评估关键AMRDEGS对ARDS的预测能力，作者整合了两个诊断基因的表达，构建了风险评分模型：在发现队列（AUC = 1，图7A）和验证队列（AUC = 0.826，图7B）中，风险评分都表现出对ARDS的强大预测能力。
4. 图7C使用平均风险评分（2.231332）将发现队列的患者分为高低风险组，发现高风险组患者更容易发生ARDS，CTSB在高风险组中高表达，EEF2在低风险组中高表达。图7D是在验证队列中进行同样操作，得到相同的发现。
四、高低风险人群差异表达基因的鉴定
1. 上图7E，F：在高低风险两组患者之间共获得371个差异表达基因（214个显著上调，154个显著下调。
2. 下图8A-D：对差异表达基因进行GO和KEGG分析，差异表达基因主要与中性粒细胞活化（BP）、分泌颗粒腔（MF）、肽跨膜转运蛋白活性（CC）和NF-κ信号通路（KEGG）相关。
3. 用GSEA和GSVA对高、低危患者的基因表达进行功能富集分析。
GSEA显示：高风险患者中，同种异体移植物排斥反应（图8E）和炎症反应（图8F）等通路显著富集；低风险患者中，E2F靶点（图8G）显著富集。
GSVA显示：低风险组在E2F靶点和MYC靶点V2中显著富集，而高风险组在补体、IL6 JAK STAT3信号传导和同种异体移植物排斥反应中显著富集（图8H，I）。
五、枢纽基因的选择与调控网络的构建
1. 使用STRING数据库分析高低危组中371个差异基因的PPI，并使用Cytoscape可视化为网络（图9A）。使用CytoHubba从PPI网络中鉴定出10个候选枢纽基因：ITGAM、TYROBP、ITGB2、SPI1、PLEK、FGR、MPO、S100A12、HCK和MYC（图9B）。
2. Friends分析发现，HCK基因在枢纽基因中起着至关重要的作用（图9C）。进一步分析表明，MYC、SPI9和PLEK基因在miRNA-mRNA调控网络中发挥着显著的调控作用（图9D）。对于TF-mRNA调控网络，MYC、SPI2和ITGB9在调控中起重要作用（图9E）。
六、枢纽基因和浸润免疫细胞的分析
1. 在组合数据集中，22个浸润免疫细胞中有12个在ARDS组与正常组之间存在差异表达(图10A）。
2. 大多数不同的免疫细胞呈负相关，其中T细胞CD4幼稚和T细胞CD8之间的正相关最高（r = 0.518），活化树突状细胞和单核细胞之间的负相关最高（r = -0.639）（图10B）。
3. 不同免疫细胞和枢纽基因之间的相关性如图10C-N所示。
七、免疫表征表型的构建
1. 根据ssGSEA的分析结果，通过无监督共识聚类，将组合数据集中的ARDS患者分为两种不同的免疫表型（图11A，B；Cluster1：n = 22；Cluster 2：n = 35）。
2. 比较枢纽基因(图11C)和免疫细胞(图11D)在免疫特征表型上的差异：在免疫特征表型上有6个枢纽基因存在显著表达差异，20种免疫细胞存在显著浸润差异。
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分析差异免疫细胞(图11E)的相关性：热图显示免疫细胞间呈正相关，其中浆细胞样树突状细胞和单核细胞的正相关性最高（r=780.8，P=900.13e-11）。差异枢纽基因和免疫细胞具有相关性（图11F-K）。
八、分子表型的构建及与免疫浸润细胞的相关性分析
1. 图12A-C：根据10个枢纽基因，当聚类数为2时采用无监督一致性聚类，将组合数据集中的ARDS患者分为两种不同的分子表型（组1：n = 38；组2：n = 19）。主成分分析结果表明，两组ARDS患者可以很好地区分（图12D）。
2. 大部分枢纽基因在组1高表达，在组2低表达（图13A）。两组间的大部分枢纽基因存在显著差异，且组1的表达值显著高于组2（图13B）。
3. 在组合数据集（图13C）和GSE76293数据集（图13D）中，ARDS组大部分基因的表达值均显著高于正常组。进一步分析显示，两组之间超过70%的免疫细胞存在显著差异（图13E）。在组1(图13F)和组2(图13G)中，大多数差异免疫细胞呈正相关。
- 在组1（图14A）和组2（图14B）中，大部分枢纽基因与免疫细胞呈正相关。
图14C-L展示了组1与免疫细胞最具相关性的前十位。
图14M-V展示了组2与免疫细胞最具相关性的前十位。
研究总结：
本研究筛选出了10个与ARDS自噬和代谢相关的枢纽基因，分别为ITGAM、TYROBP、ITGB2、SPI1、PLEK、FGR、MPO、S100A12、HCK和MYC，这些基因可以将ARDS患者聚类成不同的分子表型。
此外作者探讨了ARDS患者的浸润免疫细胞及不同的免疫表型，并进一步分析它们与枢纽基因的相关性，为免疫、自噬和代谢在ARDS中的作用提供了新的视角。
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