细胞周期实验：从protocol到数据分析（附免费软件）
细胞周期，是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程，分为间期与分裂期两个阶段。细胞间期又分为C0期、G1期、S期、G2期；细胞分裂期即M期。
G0/G1期：G1期，细胞体积逐渐增大，细胞开始RNA和蛋白质的合成，DNA含量保持二倍体状态，G0期是脱离细胞周期暂时停止分裂的一个阶段。但在一定适宜刺激下，又可进入周期，从 DNA含量上无法区分G0与G1期。S期：在这一阶段完成DNA的合成以及合成与DNA组装构成染色质等有关的组蛋白。DNA含量在此时期增加，介于G1期和G2期之间。G2/M期：G2期是DNA复制结束和开始有丝分裂之间的间隙。从DNA含量上同样无法区分G2期和M期。
细胞周期的检测-------------DNA含量的变化
检测细胞周期最常用的方法就是检测细胞DNA含量，正常生长的细胞都会经历分裂过程，G0/G1期是两倍体时期，S期DNA开始合成，到G2/M期，细胞处于四倍体时期，之后细胞一分为二，进入下一个细胞周期。
一、实验操作：PI/RNase染色法：以悬浮细胞为例
1、离心收集细胞，弃上清，用预冷的PBS洗涤2次；
2、细胞固定：用残留的少许PBS混匀沉淀，缓慢加入-20°C预冷的70%乙醇，边加边摇匀，避免细胞粘连在一起，置于-20°C冰箱固定4h以上；
3、细胞染色：350g离心5min，弃上清，用2ml的PBS洗涤2次，按照10^6 cells 加入500μlPBS，含50μg/ml的 PI，100μg/ml的RNaseA，4°C避光孵育15min-30min（可将PI直接用PBS配成工作浓度，RNaseA现加进去）；
4、上机分析：由于PI具有很强的粘附性，容易使细胞聚团，建议过滤后再上机分析，同时别忘了检查流式仪器的状态，一般低速收集2-3万个细胞即可。
二、实验要点
（3）PI既能与DNA结合，又能与RNA结合，所以要用RNase降解RNA；
（4）进样速度：进样速度为低速。若峰形较宽，可能就是进样速度太快；
（5）仪器质控定期做，尽可能排除因机器设置引起的峰形加宽；
（6）排除粘连细胞（FL2-A/FL2-W），最大程度的减少粘连细胞带来的假阳性结果。
三、结果分析
结果用细胞周期拟和软件ModFit分析。分析时，先用FSC/SSC圈定细胞群体，PI-A/PI-W去除粘连体，PI-AHistogram显示周期分布。操作如下：
1、解压缩软件，不需要安装就可用；
2、打开软件，点击File（以S1样本为例）；
3、找到文件，识别FCS格式，然后open
4、弹出的窗口中选择要输出的参数PI-A
5、点击Gate1，选择图的参数为：FSC-A和SSC-A
6、点击Gate2，选择图的参数为：PI-A和PI-H
7、点击Mod，在弹出窗口中把AutoDebris和AutoAggregates的勾去掉，细胞状态好时一般不看碎片和粘连细胞。
8、OK后自动进入Range状态，微调G1和G2门的位置，告诉软件二倍体四倍体大概位置
9、点击Fit，自动拟合出结果
10、微调G2/G1值，找到RCS最小时最合适，一般1.80-2之间
11、数据输出，该破解软件数据输出有点问题；
•不过可以直接copy ，复制到office 软件中；
•或者虚拟打印机直接导出pdf 格式。
12、流式细胞周期结果图解读：
（1）纵坐标Cell Number：即计数的有效细胞数；
（2）横坐标DNA Content：即DNA含量；
（3）常用的流式细胞术分析细胞周期的方法是依据细胞DNA含量（横坐标）来分析的：
①G0/G1期：DNA复制还没开始，也是DNA含量最少的，即流式检测结果图的第一个峰；
②S期：DNA开始复制，到完成复制，是一个一倍DNA到二倍DNA的过程，在流式结果图中显示期跨度特别大（第二个不高但很宽的峰）；
③G2期：DNA复制完成至分裂的一段时间，此时细胞内含二倍DNA，在流式结果图中的第三个峰；
④M期：细胞分裂过程，此时细胞内也是二倍DNA，用DNA含量的方法是无法与G2期分开。
（4）右侧数字含义：Dip G1-83.95% at 63.44%，即G1期DNA含量平均值为83.95%；63.44%即G1期细胞数占总数的53.84%，以此类推。
关于软件，网上也有，这里提供一个百度网盘链接，大家可以根据需要自行下载。
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