摘要：
番茄的风味依赖多种挥发物的混合作用，包括多种醋酸酯。红果番茄与绿果番茄相比，积累的相对低的醋酸酯含量。研究发现，红果和绿果种之间挥发性酯含量的差异与插入一个与酯酶家族中最具酶活性的成员相邻的转座子有关。这种插入导致酯酶的高表达，导致与人类对番茄的偏好负相关的多个酯的水平降低。这种插入在红果种进化中固定下来，表明酯酶的高表达和随后的低酯含量可能为红果种的祖先提供了适应性优势。这些结果表明在分子水平上，亲缘关系密切的物种通过改变与挥发性相关的分解代谢活性而在挥发性物质产生方面表现出重大差异。
背景：
- 食物的香味包括味觉和嗅觉感受器所检测到的信息的整合。在番茄（Solanum lycopersicum）中，风味是糖、酸和多种挥发性化学物质之间相互作用的总和。虽然糖和酸是我们对番茄的品尝必不可少的，但其风味的独特性和复杂性取决于能被检测到的挥发物的混合物。。植物合成大量挥发性有机化合物。它们来源于初级和次级代谢产物，具有多种功能，如防御草食动物和病原体、植物与植物之间的相互作用、吸引传粉者和种子散布者等。大多数重要的番茄挥发物来自氨基酸、脂肪酸和类胡萝卜素前体。尽管这些挥发物对果实品质的重要性很高，但它们的合成规律仍然知之甚少。
- 植物挥发性物质产生相关基因的鉴定方法之一是基于QTL（quantitativetrait locits）的特性。这种方法利用了同一物种栽培品种间或近缘物种间的差异。在番茄中，仅含有野生种基因组片段的导入系（ILs）群体已被用于发现大量与挥发性相关的QTL，以及影响产量、类胡萝卜素产量和初级代谢产物累积的QTL。从人类口味的角度来看，将注意力集中在消费者偏好最重要的挥发物上是最有意义的。从理论上讲，最重要的挥发物是根据气味单位来确定的，也就是，一种给定的挥发物的浓度除以其气味阈值。尽管这种方法有价值，但最近的研究表明，由于挥发物和其他风味相关化学物质之间的相互作用影响感知，味觉偏好的现实情况要复杂得多。消费者偏好调查小组对大量不同种类的番茄品种进行了调查，确定了一组与偏好正相关或负相关的挥发物。
- 由于不同番茄物种受到不同物种、生物胁迫、传粉者和种子分散的能力等选择的影响，因此在番茄分支中存在很大的多样性。根据果实性状，可将其分为两个亚类。一组由具有特征的物种组成至少从人类的角度来看，是不好吃的绿色水果。第二类，包括S. lycopersicum和S. pimpinellifolium，生产可食用的红色水果。Solanum cheesmaniae和Solanum galapagense也可以放在后者中，因为它们有彩色的果实，并且在遗传上与S. lycopersicum紧密相关。S. cheesmaniae和S.galapagense产生黄色和橙色果实，并且是Galapagos的地方特色。S. cheesmaniae和S. galapagense的果实虽然可以使用，但是由于有刺激性的气味而不如S. lycopersicum和S. pimpinellifolium好吃。从进化的角度来看，有色水果物种形成了一个单系群。绿果种Solanum chmielewskii和Solanum neorickii是一个不同分支。Solanum pennellii和Solanum habrochaitesare 从S. lycopersicum中进一步分离。
- 挥发性酯类化合物是一类重要的化合物，对许多水果和花卉的香气有贡献。例如，乙酸酯是香蕉（3-甲基乙酸丁酯）、茉莉（乙酸苄酯）和苹果酸（多酯）香气的关键。尽管每种化合物的感官特性不同，但醋酸酯通常具有水果或花香的香味。乙酸酯挥发物是由醇乙酰转移酶产生的，这些酶能浓缩醇，通常也产生挥发性化合物，以及乙酰辅酶A。除了在水果和花卉中发现，醋酸酯也存在于营养组织中。例如，乙酸顺-3-己烯基酯是机械和食草动物破坏植物释放出的大量的化合物之一，表明其在植物防御中的作用。更重要的是，这种挥发性物质还能够激发植物的防御反应，在植物间的相互作用中起重要作用。
- 在这里，我们发现醋酸酯与消费者对番茄水果的喜好呈负相关。基于它们对消费者偏好的潜在负面影响以及它们对植物防御的潜在贡献，我们感兴趣的是这些化合物的含量是如何被调控的。为了确定最重要的酯积累调节因子，我们使用了从番茄的野生近缘种S.pennelliands和S. habrochaites获得的ILs。利用这些IL群体，鉴定了一个控制挥发性酯含量的主效QTL。
结果
番茄叶中的酯挥发物
- 我们之前筛选了heirloom西红柿品种大量不同化学成分，并将它们的浓度与消费者的喜好联系起来。消费者喜好得分与个体乙酸酯类和阿斯托乙酸酯类占挥发物总量百分比的相关分析表明，两者呈显著负相关。这种物质与喜好的负相关性表明，降低番茄果实中乙酸酯类的含量是可取的。
- 为了深入了解番茄中醋酸酯的积累规律，我们研究了番茄多个品种野生品系中醋酸酯的变化。野生种质的挥发性成分在乙二醇总含量上有很大的差异（图1）。与果实释放的挥发物总量相比，S. lycopersicum和S. pimpinelli-folium的乙酸酯含量较低。相比之下，绿色水果品种积累了更高水平的乙酸乙酯。在某些情况下，像S. pennellii，它们形成了被检测到的最丰富的挥发物群之一。毫不奇怪，在不同的物种和种类之间，每个酯的挥发性比例是不同的。这表明决定每一酯含量的因素是多方面的，包括底物利用率、乙酰转移酶含量和特异性以及酯酶活性。尽管在特定的酯水平上存在差异，但红果种的乙酸酯总含量实际上低于绿果种。绿色水果品种的整体香气中含有明显的酯类挥发物，可以描述为水果味和香蕉味。S. cheesmaniae和S. galapagense在一定程度上比S. lycopersicum和S. pimpinellifolium积累更多的缩醛酯。
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- 为确定红、绿果树品种间乙酸乙酯含量变化的原因，从番茄与红、绿果S. pennellii和S. habrochaites的杂交中分离出两个IL群体。一些酯含量更高的品系含有一个来自于野生种的1号染色体底部的公共片段（表1和图1）。S1），表明一个QTL影响了酯含量。这些系列中最丰富的酯是顺-3-己烯基乙酸酯、乙酸己酯、乙酸2-甲基丁酯、乙酸异丁酯和乙酸3-甲基丁酯。。尽管每种化合物含量的增加有所不同，但QTL影响了所检测到的所有醋酸酯。进一步精细定位允许我们将QTL定位到700 kb的区域。对基因组序列的分析表明，在内含子片段中存在一组同源的、排列整齐的酯酶基因（88-92%的DNA同源性）。根据酶学原理，这些酯酶可分为羧基酯酶。羧酸酯酶水解羧酸酯生成醇和羧酸盐（图2）。因此，酶被注释为SlCXE1–SlCXE5。定量PCR分析显示，只有LCX1在成熟果实中高表达，SlCXE2–SlCXE5的总转录水平低于总转录水平的0.3%（表S3）。在不同组织和果实发育的不同阶段也分析了SLCX1的表达，转录产物主要存在于果实中，在果实成熟过程中表达增加。
番茄中slCXE1基因的沉默
- 为了确定这种候选的酯酶基因是否与QTL相关的更高的酯水平有关，通过基因沉默的转基因植物来评估其功能。在Flora-Dade背景下，获得了几个SlCXE1基因表达量降低的品系。由于slCXE1和slCXE2–slCXE5高度同源，尽管与slCXE1的程度不同，这些系的其他四个基因的转录物含量降低。三个SlCXE1表达量只有不到对照的6%的株系成熟果实的挥发物含量与对照品系成熟果实挥发物含量的变化见图3。
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- 在基因沉默的株系中观察到乙酸酯的含量与ILs的QTL中的含量相近。这一结果证实了slCXE1在调节番茄果实酯含量中的作用。
slCXE1的酶活性
- 根据番茄基因组序列，slCXE1与其他四种酯酶（slCXE2–5）相比，在蛋白质的中间插入了27个氨基酸（图4）。这种CXE1直系同源基因的插入物存在于该属内所有物种中，包括Solanum tuberosum。然而，我们无法在NCBI数据库的任何其他酯酶中发现这种插入。乙酰酯酶中这种插入物的存在似乎仅限于茄科植物，而且可能仅限于Solanum属植物。来源于绿色果实的ILs中所有乙酸酯的增加表明slCXE1具有广泛的活性。为了证实这一点，我们检测了重组slCXE1酶的体外活性。由于酶中间插入物的存在会影响酶的活性，因此截短了slCXE1（图4）。截断形式（slCXE1del）缺少slCXE1的唯一序列，因此更类似于slCXE2–5。slCXE1、slCXE1del和slCXE5在大肠杆菌BL21中表达并纯化。slCXE5是剩余4个基因中表达最高的（尽管水平远低于slCXE1）。利用番茄中检测到的醋酸酯测定了三种酶的亲和常数（Km）和周转数（kcat）。正如预期的那样，slCXE1对所有测试的乙酸酯都显示出活性，尽管该酶在一些底物（包括3-甲基乙酸丁酯和乙酸己酯）中更为活跃。动力学参数与其他羧酸酯酶的公开值相似。有趣的是，截短型的slCXE1只保留了对不同底物的小部分活性，其活性与slCXE5相当。
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番茄中CxE1的5’端近端序列的差异
- 为了确定绿色果树中观察到的高酯含量是否是由于CXE1的差异表达所致，测定了LA3916、Il-1-4及其各自与亲本LA4024和M82的mRNA水平。S. pennelli和S. habrochaites和他们的亲本相比都有低CXE1的表达（图5）。RNA含量的降低与ILs中乙酸酯含量的升高有关。我们还想知道与番茄相比，是否绿色果实CXE2-5的表达也同样减少。与CXE1相比，CXE2-5的表达水平没有实质性的减少，而在水果中表达较弱。因此，我们得出结论S. lycopersicum中油酯的的减少与CXE1转录本的高水平表达相关。
- S. lycopersicum中CXE1的高水平表达表明在番茄和S. pennellii和S. habrochaites的渐渗系之间存在差异。因此，我们测定了番茄和ILs双亲的启动子区DNA序列。西红柿的启动子区域在接近（110 bp）到预测的ORF的起始密码子位置含有2300的插入（图5）。通过与植物重复数据库的比对，我们可以将插入物识别为类似copia的逆转录转座子。类copia逆转录转座子的序列在番茄基因组中非常丰富，尽管长末端重复序列（LTR）中的替换表明它们现在大多处于活动状态。对番茄基因组网络数据库中的slCXE1 ESTs的分析表明，该基因的5′UTR在转座子的LTR内延伸，表明转座子含有启动子元件，导致番茄果实中高表达。
- 我们感兴趣的是确定逆转录转座子的存在是否与物种间的酯水平相关，因此，我们对来自8个物种的5′到CXE1区域进行了测序。S. pimpinellifolium启动子区也含有类似copia的转座子。同样的插入也在S. galapagense和S. cheesmaniae中发现。然而，没有一个绿色果实的物种（S.pennelli，S.habrochaites，S.neorickii，S. chmielewskii）包含逆转录转座子。这一观察表明，转座子插入时间比绿果和红果物种之间的分化要晚。通过假设插入时逆转录转座子的两个LTR是相同的，可以估计插入事件发生在∼220万年前。这一估计将转座子插入红果种和绿果种之间的差异之后，但在红果种组内的物种形成之前。
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讨论
鉴定影响风味的基因一直是提高家养果蔬品质的重要途径。包括西红柿、甜瓜和草莓在内的几种作物的商业品种经常被看到缺乏对消费者的吸引力。现代育种具有产量、抗病性、外观、采后货架期等重要性状。大量影响挥发物产生的基因以及对挥发物缺乏认识，对育种家提出了重大挑战。挥发物途径的表征将提供有价值的工具，将其作为育种过程的重要组成部分。在本研究中，slCXE1被认为是果实中酯挥发物含量的关键调节因子。番茄中slCXE1的表达相对较高，结果是醋酸酯含量较低，影响了果实的挥发性，从而影响了果实的整体香气。尽管slCXE1在酯的总含量中起着一定的作用，但其他因素可能会影响每个乙酸酯的含量。特别是，乙醇乙酰转移酶的底物池和底物特异性可能影响番茄和不同野生种中不同酯的积累。因为在公布的番茄基因组序列中，没有一个已知的醇乙酰转移酶能mapping到1号染色体的底部，与1号染色体QTL相关的酯含量的大幅度增加表明了lcxe1在区分绿色和红色果实物种中的重要作用，这一假设与转基因植株中观察到的酯变化一致。总之，研究结果强调了分解代谢在测定植物挥发物总含量中的重要性。
在slCXE1的中心插入27个氨基酸的独特序列，显著提高了酶的亲和力和转化率。去除该序列降低了slCXE1对所有被测醋酸酯的亲和力和转化率。特别有趣的是，这种活动上的差异是我们没有在Solanum外的任何酯酶中发现这种插入序列。SlCXE1及其旁系同源基因SlCXE5（图4）的计算机模拟表明，该插入物位于酶活性位点附近。因此，这种插入可能有助于更有效地粘合和/或翻转基底。
独特的27个氨基酸插入slCXE1导致了相对其旁系同源酶活性的显著提高。综上所述，这些结果证实了slCXE1在决定番茄风味中的重要作用。slCXE1的高表达与该基因启动子区出现类似copia的逆转录转座子有关。类Copia逆转录转座子在番茄基因组中非常丰富，可能是物种多样性的重要来源。逆转录转座子基因的转录启动子可以对其表达产生不利的影响。…… 反转录因子也可以积极影响基因表达。……
反转录转座子的插入最有可能发生在番茄枝内绿色和红色果实品种分化后。
番茄枝内绿色和红色果实种类之间的酯挥发分含量差异表明，亲缘关系密切的种类已经进化到积累不同的挥发物平衡。
综上所述，我们已经证明，红、绿果实番茄品种间的挥发性酯酶含量的差异与转座因子直接插入酯酶家族中最具酶活性成员的5′有关，这种插入事件的结果是降低了多种酯类的含量，这与人类偏好呈负相关。
材料方法
略
reference:
Goulet, C. , et al. "Role of an esterase in flavor volatile variation within the tomato clade." Proceedings of the National Academy of Sciences 109.46(2012):19009-19014.
