文章标题: 成纤维细胞衰老在预测人类癌症免疫治疗反应和预后中的独特路线图
PMID: 39739618
数据分析流程：
主要内容：
（一）TME中细胞的衰老图谱
作者分析了40个包含881332个细胞的全癌症scRNA-seq数据集，在分离和聚类高质量细胞后，（表S1，支持性信息）。使用来自CellAge数据库的基因组（网址：//genomics.senescence.info/cells）作为衡量细胞衰老的指标，基因组变异分析（GSVA）显示CAFs表现出最高的GSVA评分。作者上述中位衰老评分，将CAF分为高衰老（HS-CAF）和低衰老（LS-CAF）亚组。细胞通讯分析显示，与LSCAF相比，HS-CAF在TME内表现出显著更高程度的相互作用，特别是与免疫细胞亚群的相互作用。
（二）通过泛癌症scRNA-seq分析建立FSS
在泛癌scRNAseq数据集中，作者进行了斯皮尔曼相关分析，以检查成纤维细胞中基因表达水平与衰老评分之间的相关性。与衰老评分呈正相关（Spearman R > 0且HDR < 0.05）的基因被鉴定为FSx，而在成纤维细胞中表现出差异上调的基因被标记为FSy。通过交叉FSx和FSy，作者得到了FSN，代表每个数据集与衰老正相关的上调成纤维细胞特异性基因。作者通过基因本体（GO）和京都基因和基因组百科全书（KEGG）的途径富集分析进一步探索了FSS中包括的生物事件。这些途径主要在细胞周期、遗传重塑、癌症相关和ICI相关过程中富集。
（三）探索FSS与免疫抑制之间的相关性
为了更深入地研究FSG和TME之间的相关性，作者通过GSVA R包基于109个FSG基因，从30种癌症类型的TCGA数据集中计算了每位患者的FSG评分。一般来说，作者的分析显示，头部和颈部鳞细胞癌（HNSC）、乳腺癌（BRCA）和膀胱癌（BLCA）等实体肿瘤的ASS评分较高，而睾丸生殖细胞肿瘤（TCGT）、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤（PCPG）以及肾脏乳头状细胞癌（KIRP）评分较低（图S2，支持信息）。然后，使用R包MPP计数器来评估免疫细胞的丰度，而表现出高FSG评分的肿瘤显示抗肿瘤免疫细胞（包括CD 8 + T细胞、NK细胞和巨噬细胞）的渗透减少（图3D）。随后，作者进行了FSG评分和HALLMARK基因集之间的相关性分析，以探讨免疫抑制途径是否在具有高FSG评分的肿瘤中富集。研究发现，顶级途径，例如TGF-RST信号传递、细胞死亡、Notch信号传递和缺氧途径，在具有高FSG评分的患者中被上调（图3E）。此外，还进行了一系列分析，比较了肿瘤突变负荷（TMB）和FSG。
（四）基于FSS的ICI响应预测
为了检验FSS在预测ICI反应方面的潜力，作者收集了14个ICI队列，其中包含完整的测序数据和免疫治疗的临床结果。然后，使用10种ML，并使用10倍CV的5次重复进行验证。为了提高模型精度，作者使用不同的随机种子进行了5次优化过程。作者计算了验证集内这些模型的曲线下面积（AUC）值。因此，在执行这些数学方法后，作者最终选择梯度增强机（GBM）作为最佳模型，其产生的最大AUC为0.86为了进一步探索FSS的强度，作者在测试组（n = 190）和作者的内部组（n = 41）中应用GBM方法，得到AUC值为0.79和0.77。然后，将患者分类为高风险（预测NR）和低风险根据Kaplan-Meier图，低风险组在验证、测试和内部组中表现出有利的总体存活（OS）结果。此外，为了评估FSS在预测ICI反应方面的综合价值，作者评估了其针对既定泛癌症特征的功效。
（五）基于FSS的生存预测
为了优化FSS在泛癌症水平上的生存预后预测，采用了SurvBenchmark设计建立了基于FSS的生存模型。该模型纳入了15种特定于生存的机器学习方法。来自TCGA的泛癌症患者被分为两组：训练集占80%（n = 7865），验证集占20%（n = 1950）。利用训练集，基于FSS开发了一个预后模型，随后使用验证集计算了AUC、时间依赖性AUC和C_index。如图5A所示，MTLR_DE在验证集中表现优异，被确认为最优模型。MTLR_DE代表一种多任务逻辑回归模型，采用基于排名的方法作为特征选择方法。在此算法中，基于入选数据集的中位生存时间进行良好与不良OS的差异表达（DE）分析作为特征选择方法，最终筛选出了10个基因（CDC6、PITXQ、TGFBI、CHEK1、CEBPB、IFI16、CD82、PGR、PEBP1和RBL2）。为了验证基于训练集的模型，作者通过MTLR算法和MTLR R包计算了每个患者的个体风险评分。如图5C所示，通过AUC值在验证、测试和院内数据集中的验证，最终模型的卓越表现得到了验证。此外，所有参与者群体中，风险评分较高的个体展示了较差的OS率，这一结果与TCGA泛癌症队列中的大部分数据集一致。进一步通过将与FSS相关的风险评分与美国癌症联合委员会（AJCC）分期结合，创建了一个列线图，以提高上述风险评分在泛癌症数据集中的预测准确性。
（六）CRISPR/Cas9筛选通过FSS识别潜在靶点
识别ICI（免疫检查点抑制）反应的潜在靶点对于推动FSS的临床应用至关重要。为了实现这一目标，作者从7项CRISPR/Cas9研究中筛选了17个CRISPR/Cas9队列，按细胞系类型和处理条件对基因敲除进行分类，并整合了ICI反应信息。共纳入22505个CRISPR基因，通过z-score排序，将排名靠前的基因定义为免疫耐药基因。本质上，排名靠前的基因可能在基因敲除后增强抗肿瘤免疫，而排名较低的基因则可能阻碍免疫反应。随后，作者将FSS中的高排名基因与已有的免疫耐药基因签名（包括TcellExc_sig，ImmuneCells_sig，IMS_sig，CAF_sig，和 CRMA_sig）进行比较。结果显示，FSS中排名靠前的基因比例最高。令人感兴趣的是，FSS中排名前10%的基因（n = 15）在这些基因中的比例异常高（Fisher精确检验，p < 0.01）。经过在多个独立CRISPR/Cas9数据集中的进一步验证，这些基因被发现是免疫治疗靶向的有前景的候选基因。为了进一步探索既能预测ICI反应又能预测生存的靶点，作者分析了从CRISPR/Cas9数据集中选出的15个基因和FSS-based预后模型中的10个基因。最终，CDC6被确定为核心基因。如图6C所示，在22个泛癌症队列中的19个（86%）中，CDC6的mRNA水平在肿瘤标本中显著高于正常组织，这种升高的CDC6表达与不良的OS相关。通过免疫组化（IHC）分析Human Protein Atlas（HPA）数据集也表明，CDC6在肾脏、肝脏、胰腺和皮肤的肿瘤样本中表现出较高的蛋白表达水平。
（七）CDC6在胰腺癌细胞中的下调增强了对免疫治疗的反应
为了阐明CDC6在抗肿瘤免疫中的作用，作者建立了一个共培养系统，包括CD8+ T细胞和CD14+ 单核细胞来源的巨噬细胞与胰腺癌（PC）类器官的共培养。在对PC类器官进行CDC6敲低后，作者确认了CDC6的mRNA和蛋白表达均显著降低。值得注意的是，作为经典衰老标志物的p16的表达也随之减少，提示CDC6沉默可能减弱了肿瘤微环境（TME）中成纤维细胞的衰老。形态学评估和CTG分析显示，sh-CDC6组PC类器官的生长动力学显著受损。此外，免疫组化（IHC）分析显示，sh-CDC6类器官中PD-L1和Ki-67的表达显著低于对照组。
qRT-PCR分析共培养系统揭示，sh-CDC6类器官与细胞相互作用时，ICI相关基因显著上调。与此同时，作者观察到M2型巨噬细胞相关标志物表达降低，同时M1型巨噬细胞标志物表达升高，表明巨噬细胞的极化从促肿瘤向抗肿瘤转变。流式细胞术分析进一步证实了这些发现，表明sh-CDC6类器官中的CD8+ T细胞激活和增殖增强，并且与sh-NC组相比，M1型巨噬细胞的极化倾向更强。为了在体内验证这些观察结果，作者在C57BL/6小鼠中建立了KPC亚皮下异种移植肿瘤，并腹腔注射了抗IgG或抗PD1抗体。值得注意的是，CDC6缺失的肿瘤对抗PD1治疗表现出显著的敏感性，肿瘤回归更为显著。对肿瘤标本的免疫组化分析显示，CDC6缺失的肿瘤中免疫细胞浸润增加，增殖指数降低。总的来说，这些发现突出了CDC6在调节TME中的免疫环境方面的关键作用，并提示其抑制可能增强胰腺癌免疫治疗的效果。
（八）肿瘤细胞来源的CDC6通过TGF-𝛽1分泌和氧化应激驱动成纤维细胞衰老
为了研究CDC6与成纤维细胞衰老之间的功能关系，作者建立了一个肿瘤细胞-成纤维细胞共培养系统。在PC细胞中过表达CDC6显著诱导了共培养成纤维细胞的衰老，表现为增强的SA-β-半乳糖苷酶活性、增加的p16+成纤维细胞群体和衰老相关分泌表型（SASP）因子的表达升高。
鉴于TGF-𝛽1作为细胞衰老的经典调控因子的作用已经得到广泛验证，结合作者的研究发现TGF-𝛽信号通路在FSS相关通路中排名第一，并在MTLR_DE模型中作为一个主要候选因子，作者进一步探讨了其在CDC6介导的成纤维细胞衰老中的潜在作用。结果确认，CDC6过表达的肿瘤细胞在细胞内和共培养介质中TGF-𝛽1水平显著升高，通过ELISA进一步验证了这一结果。
共培养的成纤维细胞表现出TGF-𝛽 SMAD2/3信号级联反应的激活，触发了纤维化和衰老程序。值得注意的是，使用LY2109761药理学抑制TGF-𝛽信号通路可以消除CDC6诱导的成纤维细胞衰老，表明TGF-𝛽1在这一过程中是一个关键的介导因子。
由于CDC6已被发现与应激诱导的衰老相关，作者接下来检查了氧化应激的作用。N-乙酰半胱氨酸（NAC）作为一种强效抗氧化剂，已被证明能够抑制氧化应激反应。为了阐明氧化应激在此过程中的潜在作用，作者在共培养系统中添加了NAC，并研究了其对CDC6介导的细胞衰老的影响。结果显示，NAC处理显著减少了与PC细胞共培养的成纤维细胞衰老，表现为SASP因子表达减少和SA-βgal+细胞比例降低。
最后，在胰腺癌的正位小鼠模型中，高CDC6表达与更严重的成纤维细胞衰老和对ICI治疗的反应减弱相关。这些发现表明，CDC6通过调控氧化应激在CDC6/TGF-𝛽1诱导的成纤维细胞衰老中发挥作用，从而调节ICI反应。
（九）CDC6抑制剂的高通量虚拟筛选（HTVS）
目前，还没有针对CDC6的商业化抑制剂。为了解决这一问题，作者进行了基于结构的HTVS筛选，筛选了23100种化合物，旨在发现潜在的CDC6抑制剂。
作者依次进行了标准精度（SP）和额外精度（XP）对接分析，最终选出了排名靠前的化合物。在这些化合物中，β-D-N(4)-羟基胞苷二磷酸（三铵盐）（NHC）显示出对CDC6蛋白表达最强的抑制作用（见图8K；及表S6，支持信息）。NHC-二磷酸（三铵盐）通过9个氢键和5个盐桥与CDC6相互作用。多个磷酸氧原子作为氢键受体，与GLY205、GLY207、LYS208、THR209、ALA210和ARG388形成6个氢键，氢键距离分别为1.9、2.2、2.5、2.1、1.7和1.5 Å。2个羟基作为氢键供体，与THR166和TYR346形成2个氢键，氢键距离分别为1.9和1.7 Å。此外，一个氨基氢原子作为氢键供体，与PRO173形成一个氢键，氢键距离为2.1 Å。此外，NHC-二磷酸（三铵盐）与LYS208形成两个盐桥，并与ARG388形成三个盐桥。
总结
方法：基因集评分+泛癌单细胞+免疫治疗队列+机器学习+分子对接+类器官培养+体内外实验
#泛癌单细胞 #机器学习 #免疫治疗 #分子对接
